Мыши-химеры и элементарная математика
У млекопитающих клетки раннего зародыша (бластомеры) выбирают одну из двух судеб. Клетки, оказавшиеся снаружи, становятся клетками трофобласта, в дальнейшем они участвуют в образовании внезародышевых оболочек; в составе взрослого организма их потомков нет. Клетки, оказавшиеся внутри, становятся клетками внутренней клеточной массы (ВКМ); именно из них и развиваются все ткани и органы взрослого животного. Сколько же клеток выбирают ту или иную судьбу на каждой из стадий? Например, сколько (в среднем) клеток становятся клетками ВКМ из потомков бластомеров четырехклеточного зародыша? Или восьмиклеточного?
Ответить на этот вопрос удалось, когда в 1960-е годы Беатриса Минц (Beatrice Mintz) и Анджей Криштоф Тарковский (Andrzej Tarkowski) получили первых аллофенных мышей — животных-химер. Для этого Минц разработала такую методику (см. рис. 1).
Ранних (восьми- или четырехклеточных) зародышей мышей двух разных линий — черных и белых — освобождали из яйцевой оболочки, обрабатывая ферментом проназой; затем их сближали в культуре, в результате происходило объединение зародышей и перемешивание бластомеров. Потом химерный зародыш подсаживали в матку суррогатной матери. У нее рождались мышата. Некоторые из них были черными, некоторые — белыми, а некоторые — пестрыми, черно-белыми (химерными); рис. 2.
У таких мышат было по четыре родителя (в некоторых опытах Минц — больше, до 16). В состав их внутренней клеточной массы вошли, следовательно, клетки и «черного», и «белого» зародышей. По проценту родившихся химерных мышей и оказалось возможным определить, какое число клеток зародыша образует внутреннюю клеточную массу.
Задача
Сливают два четырехклеточных зародыша. Предположим, что шансы любой клетки попасть во внутреннюю клеточную массу равные. Какая доля химерных мышей родится, если из восьми клеток в состав внутренней клеточной массы попадает одна? Две? Три?
Подсказка
Черных и белых клеток у зародыша — не бесконечное множество, а определенное число (по четыре).
Решение
На самом деле разделение на ВКМ и трофобласт происходит на следующей, 16-клеточной, стадии. Клетки восьмиклеточного зародыша либо дают потомка, который входит в состав ВКМ, либо не дают. Но, поскольку от каждой клетки в состав ВКМ попадает 1 потомок или 0 потомков, суть задачи от этого не меняется.
Если в состав ВКМ входит только одна клетка, то химерных мышат не будет (клетка либо черная, либо белая). Если клеток две, то подумаем, с какой вероятностью обе они окажутся белыми. Шанс, что белой будет первая из двух клеток, равен 1/2. Но после этого останется три белых клетки и четыре черных, так что шансы уже не равны: шанс выбрать вторую белую клетку не 1/2, а только 3/7. Так что вероятность того, что обе клетки будут белыми, составляет 1/2 · 3/7 = 3/14. Аналогично — для двух черных. Вероятность того, что из двух клеток одна будет черная, а другая белая, составляет 1 – 6/14 = 8/14 (примерно 57%).
Теперь рассмотрим ситуацию для трех клеток. Пусть в мешке лежит 8 шариков: 4 белых и 4 черных. Сколькими способами можно выбрать три из них? Математики утверждают, что число способов С38 = 8!/5!·3! = 56.
Итак, общее число вариантов выбора трех клеток из восьми возможных — 56. Из них все белые клетки можно выбрать четырьмя способами (1,2,3; 1,2,4; 1,3,4 и 2,3,4). Все черные — аналогично. Остальные варианты будут содержать и черные, и белые клетки, то есть дадут химерных мышат. Итак, химер будет 56 – 8/56 = 48/56 = 6/7 (примерно 86%).
Другой вариант решения — считать, что клетки мы выбираем последовательно. Тогда шанс выбрать первую белую клетку — 4/8, или 1/2. После этого остается три белых клетки и четыре черных. Шансы, что и вторая клетка окажется белой, — 3/7. Тогда остается две белых и четыре черных клетки, и шанс опять выбрать белую — 2/6. Перемножив 4/8·3/7·2/6, получаем 4/56.
Итак, если три клетки из восьми входят в состав ВКМ, то должно родиться около 86% химерных мышат.
Благодарю А. В. Хачатуряна за консультацию по математическим аспектам задачи.
Послесловие
Ты втолкуй нам, что черное — черно,
Растолкуй нам, что белое — бело.
Н. Матвеева
Эта задача опубликована в одном из ведущих учебников эмбриологии (Gilbert S.F., Developmental Biology, 9th Edition) — и там приведено неверное решение!
Вот что пишет Скотт Гилберт, ссылаясь на работу Минц 1970 года: «Каждая клетка с равной вероятностью может стать частью трофобласта или ВКМ. ... Если бы в формировании ВКМ принимала участие лишь одна клетка, то все мышата были бы только белыми и черными: химер не появилось бы. Если бы ВКМ образовывалась из двух клеток, то четверть потомков была бы белой, четверть — черной и половина — химерными, со смешанной окраской (1ББ : 2БЧ : 1ЧЧ). Если бы в состав ВКМ входили три клетки, то химерных мышат родилось бы 75% (1БББ : 3ББЧ : 3БЧЧ : 1ЧЧЧ). Если же клеток в состав ВКМ входило четыре, то частота появления мышат со смешанной окраской составила бы 85,7%. По данным статьи Минц, частота появления аллофенных мышей со смешанной окраской составила 73%. Таким образом, оказалось, что из [восьми] клеток компактизованного зародыша в состав ВКМ входят три клетки». (Перевод С. Глаголева)
Приняв такое решение за чистую монету, я предложил эту задачу слушателям Московской школы биоинформатики). Но среди слушателей были математики, объяснившие мне (не без труда), что решение — неправильное. (Вот и верь после этого авторитетным учебникам!)
К сожалению, мне не удалось найти исходную статью Б. Минц. Гилберт указывает, что Минц «ставила эти опыты сотни раз», но не указывает, сколько же мышат было изучено. Вполне возможно, что отклонение от ожидаемых 86% статистически недостоверно. Возможно также, что иногда ВКМ образуют три клетки зародыша, а иногда — две.
В 2001 году — сорок лет спустя после своего первого сообщения о получении химерных мышей — Анджей Тарковский с соавторами опубликовал статью (см. A. Tarkowski, et al. How many blastomeres of the 4-cell embryo contribute cells to the mouse body?), в которой попытался ответить на этот же вопрос для четырехклеточных зародышей мыши. Для этого в разных сочетаниях (1 + 3 и 2 + 2) «слепляли» отдельные бластомеры черных и белых мышей. И количественные данные (в этой статье подсчеты велись правильно), и качественные (среди эмбрионов 2 + 2 почти половина были не химерными) говорят в пользу того, что в состав ВКМ входят, как правило, потомки двух клеток четырехклеточного зародыша. В более ранних работах было показано, что при слиянии трех восьмиклеточных зародышей, взятых у мышей с разной окраской, иногда получаются трехцветные химеры. Но в этом случае объем зародыша гораздо больше обычного. Из этих результатов, оказывается, можно сделать довольно важный вывод: если нужно получить химер из трех типов клеток, это вряд ли можно сделать путем слияния бластомеров четырехклеточных зародышей. Нужно брать для этого бластомеры восьмиклеточных зародышей.
Замечательно, что исходная посылка описанной в задаче модели — «каждая клетка с равной вероятностью может стать частью трофобласта или ВКМ», скорее всего, тоже неверна. Оказалось, что уже на стадии 4–8 бластомеров клетки зародыша различаются: они делятся на две четкие группы по характеру транспорта в ядро и из ядра одного из основных «генов плюрипотентности» — Oct4 (см.: N. Plachta et al., 2011. Oct4 kinetics predict cell lineage patterning in the early mammalian embryo и M. Zernicka-Goetz, 2012. Proclaiming fate in the early mouse embryo). Клетки, в которых экспорт и импорт Oct4 происходит медленнее, а его содержание в ядрах выше, делятся преимущественно асимметрично: один из их потомков входит в состав ВКМ, а другой остается в составе трофобласта. А клетки с противоположными характеристиками делятся симметрично и вклада в ВКМ не дают.
Так сколько же клеток восьмиклеточного зародыша дают потомков, входящих в состав ВКМ? Оказывается, точного ответа на этот вопрос никто не знает. Подумайте, как это можно было бы выяснить.
И в заключение — немного в сторону от задачи. Надеюсь, читатели понимают, что на самом деле все эти «игры с эмбрионами» — вовсе не забава для ума. Мышиные химеры сыграли (и продолжают играть) важную роль в изучении эмбрионального развития и раковых заболеваний, а Беатриса Минц за свою долгую жизнь (сейчас ей 92 года) сделала множество выдающихся открытий. В частности, ей удалось доказать, что клетки злокачественной опухоли тератокарциномы при пересадке в эмбрион мыши дают нормальные ткани и органы. Ее работы стали одним из истоков получения и изучения эмбриональных стволовых клеток.
Кроме того, получение химерных эмбрионов — хороший пример эмбриональной регуляции. Клетки раннего зародыша млекопитающих могут прекрасно сформировать организм, если их число вдвое больше обычного. А если вдвое меньше? Оказывается, тоже могут. На практике это означает, что от эмбрионов человека, полученных при экстракорпоральном оплодотворении, вполне можно аккуратно отщипнуть по клеточке — посмотреть, нет ли в них лишней 21-й хромосомы или еще каких-то дефектов. И выбрать для имплантации лучшие.
