Новый метод MicroED определяет молекулярную структуру вещества за полчаса

Рис. 1. Определение структуры молекулы прогестерона с помощью нового метода электронной дифракции. Порошок из банки с прогестероном высыпают на салфетку, слегка измельчают, наносят крупинки на специальную сетку для помещения в электронный микроскоп, в микроскопе образец замораживается до температуры жидкого азота, крупицу (нанокристалл) облучают пучком электронов, в течении трех минут собирают данные дифракции электронов на специальную КМОП-матрицу, анализируют их компьютерной программой, и через десять минут программа выдает рисунок структуры с разрешением менее одного ангстрема (1Å). Синей сеткой вокруг атомов обозначена амплитуда их вибрации. Весь процесс от открытия банки до получения структуры занимает менее получаса. Рисунок из обсуждаемой статьи

Достоверное определение молекулярной структуры вещества (особенно новых веществ) — это почти всегда длительный процесс, включающий в себя очистку, приготовление образцов и использование нескольких независимых аналитических и физических методов анализа. Он может занимать дни, недели или месяцы. Но похоже, мы находимся на пороге революции в этой области: исследователи из США выложили в открытый доступ препринт статьи с описанием нового прямого метода определения структуры органических молекул в твердом виде при помощи электронной дифракции, который выдает результат буквально за полчаса. Такой прорыв стал возможен благодаря облучению образца пучком электронов с разных сторон и специально разработанному алгоритму анализа получающейся дифракционной картины.

С самого начала истории химии определение структуры веществ было одной из самых важных и при этом самых сложных задач. Практически все химические исследования или рутинные проверки включают в себя определение структуры вещества. В художественных фильмах, отнюдь не только фантастических, очень часто можно видеть, как химик кладет только что найденный образец в прибор — и у него на экране сразу появляется структура доселе неизвестной молекулы. У настоящих химиков такие кадры могут вызвать лишь ухмылку. Кое-какие методы мгновенного определения структуры есть и используются, например, в аэропортах для поиска наркотиков и взрывчатых веществ. Но все эти методы нацелены на очень ограниченное количество молекул, все без исключения являются косвенными и структуру чего-либо нового, не заложенного в них, распознать не способны.

Создано и множество лабораторных методов, которые применяются, когда скорость не очень важна, зато нужно как можно точнее выявить структуру молекулы. Это определение точек кипения и плавления, измерение спектров поглощения и отражения волн различных длин (см. Ультрафиолетовая спектроскопия и Инфракрасная спектроскопия), элементный и спектральный анализы (определение продуктов горения и их спектров) и многие другие. В наши дни наиболее популярными являются ЯМР-спектроскопия, масс-спектрометрия и рентгенокристаллография. Первые два метода — косвенные: с их помощью структура определяется не напрямую, а через сигналы взаимодействия магнитных ядер с магнитным полем (в случае ЯМР-спектроскопии) и через определение молярных масс ионизированных продуктов распада (в случае масс-спектрометрии). Из-за косвенности определить структуру не всегда получается, и возможны ошибки. На данный момент нет компьютерной программы, которая, проанализировав полученные этими методами спектры, сможет определить структуру нового вещества. Поэтому золотым стандартом считается третий метод — рентгенокристаллография.

Этот метод основан на измерении дифракции рентгеновских лучей, отраженных от кристалла вещества: из полученной дифракционной картины высчитывается молекулярная структура с разрешением до отдельных атомов, если они больше водорода (атомы водорода видны не всегда, и их расположение часто экстраполируют). Структуры, определенные этим методом с достаточно хорошим разрешением, сомнению почти никогда не подвергаются, и всё бы хорошо, но далеко не любое вещество можно кристаллизовать. И даже когда кристаллизовать получается, кристалл должен быть высокого качества (с небольшим количеством дефектов) и видимого размера (желательно — миллиметрового). На получение таких кристаллов могут уходить недели, процесс сложно воспроизводим и во многом зависит от случая. Тем не менее многие журналы и рецензенты отказываются принимать публикации о новых веществах без рентгеноструктуры. Да и сами химики без этого анализа часто не могут быть уверены в своем открытии и даже в правильности анализа известных веществ.

Поэтому несложно представить возбуждение, охватившее химиков во всем мире, когда неделю назад в открытый доступ на сайте препринтов химических статей chemrxiv.org была выложена статья с описанием прямого метода определения структуры молекул, который требует всего нескольких десятков минут, подходит почти для любых твердых веществ и для которого хватает наноразмерного образца (рис. 1). Вещество всё равно должно быть в кристаллической форме, но размер может быть настолько крохотным, что получить кристаллы достаточного качества (без дефектов) не представляет трудности. Настолько мелкие кристаллы зачастую образуются спонтанно при высушивании раствора — проблему для применения в рентгенокристаллографии представляет их многократное укрупнение без образования дефектов. Метод, названный авторами MicroED (аббревиатура от micro-electron diffraction — «микроскопия + электронная дифракция»), является адаптацией и улучшением технологии электронной кристаллографии в криоэлектроннoй микроскопии, которая использовалась до сих пор для определения структуры белков, и за которую была вручена Нобелевская премия по химии в 2017 году.

Так как взаимодействие электронов с веществом намного сильнее, чем у рентгеновских фотонов, для получения высокого разрешения требуется значительно меньшее количество сканирований и, соответственно, кристалл намного меньшего размера. Однако, для небольших молекул эта технология раньше была неприменима из-за быстрого разрушения образцов высокоэнергетичным пучком электронов. Авторы новой методики решили эту проблему снижением интенсивности пучка в 200 раз (по сравнению с использовавшимися ранее методами электронной дифракции) и сканированием крупицы вещества под множеством разных углов (образец вращается со скоростью 0,5 градуса в секунду). Сыграли роль также появление суперчувствительных матриц и разработка компьютерной программы, обрабатывающей полученные данные, — структура молекулы, разумеется, высчитывается математическими алгоритмами (так же, как в рентгенокристаллографии).

Первоначально эта методика была описана в 2013 году для более качественного определения структуры белков, замороженных в водном растворе (D. Shi et al., 2013. Three-dimensional electron crystallography of protein microcrystals). И вот, спустя пять лет, ученые под руководством Тамира Гонена (Tamir Gonen), который занимался разработкой MicroED, при содействии группы Брайена Штольца (Brian M. Stoltz) адаптировали эту технологию для почти любых нанокристаллов небольших нерастворенных молекул.

Помимо прогестерона авторы обсуждаемой статьи определили структуры десятков известных веществ: лекарственных препаратов, витаминов и натуральных продуктов. Среди них были и довольно крупные молекулы, как, например, тиострептон (thiostrepton, рис. 2). Большие молекулы (как белки) должны быть заморожены в водной матрице, чтобы уменьшить спонтанное движение групп, ухудшающее разрешение. Кристаллы небольших молекул и так достаточно плотные, поэтому заморозка в матрице не требуется. Но чем молекула больше, тем хуже разрешение нового метода.

Рис. 2. Структура молекулы тиострептона, полученная методом MicroED. Атомы углерода показаны синим, кислорода — красным, азота — желтым. Атомы водорода не показаны, чтобы не усложнять картину. Рисунок из обсуждаемой статьи в chemrxiv.org

Hа вид аморфные (без заметных невооруженным глазом кристаллов) порошки были проанализированы прямо в том виде, в каком они были получены от поставщиков, без какой-либо дополнительной обработки — их даже не всегда надо было измельчать. Объемы нанокристаллов вещества были в миллиарды раз меньше необходимого для рентгенокристаллографии. Авторы продемонстрировали дополнительное преимущество MicroED: блaгодаря сильному взаимодействию электронов с веществом он часто напрямую определяет расположение атомов водорода в анализируемой молекуле (гораздо чаще, чем это происходит при рентгенокристаллографии).

Вещества «из коробки», возможно, проходят через кристаллизацию — это может быть частью процедур очистки перед продажей. Поэтому для лучшей демонстрации потенциала метода авторы решили проверить его на веществах, которые не были намеренно кристаллизованы, а были только что очищены жидкостной хроматографией в их лаборатории. С такими веществами структура была успешно расшифрована без какой-либо обработки в двух из четырех проверенных случаев (молекулы (-)-лимаспермидина и оксиндола).

Рис. 3 демонстрирует еще одну уникальную возможность, которую предоставляет метод MicroED. Несколько веществ (биотин, цинхонин, карбамазепин и бруцин) смешали, смесь поместили под микроскоп и в течении нескольких минут, учитывая уже полученные данные на индивидуальных образцах, смогли определить, к какому из четырех веществ относится каждый отдельный нанокристалл.

Рис. 3. MicroED-анализ смеси смеси кристалликов биотина, цинхонина, карбамазепина и бруцина позволил определить, где какое вещество, за считаные минуты. Метод рентгенокристаллографии на такое и близко не способен. Рисунок из обсуждаемой статьи в chemrxiv.org

Авторы надеются, что метод вскоре станет стандартным для анализа и определения структуры веществ в любой химической лаборатории. Возможно, скоро сцены химического анализа из плохих (с точки зрения отражения «химических» реалий) фильмов станут реальностью.

* * *

В тот же день была опубликована работа европейской конкурирующей группы исследователей из Германии и Швейцарии с очень похожим методом, который авторы пока никак не назвали. Как и их американские коллеги, они используют чувствительный детектор, но механизма, постепенно вращающего кристаллы, у них нет, и они их не замораживают. Вместо этого они выбирали более крупные кристаллы (микро- вместо наноразмерных) и сканировaли тонким пучком электронов разные регионы, чтобы собрать достаточное для анализа число сканирований. Такие кристаллы, хоть и более крупные, всё еще гораздо меньше, чем требуются для рентгенокристаллографии в лабораторных условиях.

Своим методом исследователи проанализировали всего две молекулы. Первая — это молекула парацетамола. Чтобы получить ее структуру авторы просто раскрыли капсулу с порошком (pис. 4a), который в основном состоит не из парацетамола, а из различных некристалличных (аморфных) наполнителей.

Рис. 4. Определение структуры молекулы парацетамола из капсулы. a — открытая капсула; b — кристалл парацетамола увиденный в микроскопе; c — дифракция электронов отражённых от кристалла; d — полученная структура парацетамола; атомы кислорода красные, азота — синие, углерода — черные, водорода — белые в синих кружочках. Рисунок из статьи в Angewandte Chemie

С помощью микркоскопа увидеть микрокристалл (pис. 4b) не составило труда, и через 10 минут электронной дифракцией (pис. 4c) была получена структура парацетамола с водородами и высоким разрешением (pис. 4d). Вторая молекула — метиленовый синий — важный индустриальный краситель используемый также в фармацевтике, из которого трудно получить большие кристаллы, пригодные для рентгенокристаллографии.

* * *

Источник: Christopher G. Jones, Michael W. Martynowycz, Johan Hattne, Tyler Fulton, Brian M. Stoltz, Jose A. Rodriguez, Hosea M. Nelson, Tamir Gonen. The CryoEM method MicroED as a powerful tool for small molecule structure — препринт на сайте chemrxiv.org.

См. также:
Robert F. Service. ‘A new day for chemistry’: Molecular CT scan could dramatically speed drug discovery — колонка, посвященная обсуждаемой статье на сайте журнала Science.

Григорий Молев