Инсулин «в таблетках» прошел проверку на крысах

Рис. 1. Модель молекулы инсулина человека, полученная с помощью рентгеноструктурного анализа. Красная спираль на переднем плане — это B-цепь, за ней, тоже красная, A-цепь. Зеленые — N- и C-концы полипептидных цепей (N-конец — это часть молекулы, где торчит аминогруппа первой аминокислоты, C-конец — это окончание молекулы, где торчит карбоксильная группа). Изображение из статьи: V. I. Timofeev et al., 2010. X-ray investigation of gene-engineered human insulin crystallized from a solution containing polysialic acid

Попытки заменить инъекции инсулина таблетками начались еще несколько десятилетий назад. Однако до сих пор ни один препарат не вышел на массовое производство. Ученые из Гарвардского университета (США) и Калифорнийского университета в Санта-Барбаре разработали капсулы с инсулином в виде ионной жидкости, которые снижают уровень глюкозы в крови на длительный период. Теперь исследователи хотят получить одобрение на клинические испытания с участием людей.

В живых организмах постоянно происходит огромное количество химических реакций, которые направлены на поддержание жизни. Совокупность этих реакций принято называть обменом веществ, или метаболизмом. Все химические превращения можно поделить на два типа: реакции, в ходе которых сложные органические вещества расщепляются на более простые, и реакции, в результате которых образуются сложные молекулы из простых.

Один из регуляторов обмена веществ — белковый гормон инсулин (рис. 1), основная функция которого — снижение уровня глюкозы в крови. Инсулин запускает механизм поглощения глюкозы клетками, связываясь с рецепторами на их поверхности. Позже, эта глюкоза будет использоваться клетками по назначению. Например, в процессе гликолиза из одной молекулы глюкозы получится две молекулы пировиноградной кислоты. Также инсулин способен запустить процесс образования жиров из глюкозы в специальных жировых клетках — адипоцитах (G. Dimitriadis et al., 2011. Insulin effects in muscle and adipose tissue).

Инсулин синтезируется бета-клетками — особыми клетками, расположенными в поджелудочной железе. Строение инсулина очень простое: 51 аминокислота образует две полипептидые цепи — A и B. A-цепь содержит 21 аминокислотный остаток, а в B-цепи таких остатков 30.

Про этот гормон можно смело сказать «мал, да удал», поскольку инсулин, один из самых маленьких среди белковых гормонов по размеру и количеству аминокислот, участвует в большом количестве процессов в организме (для сравнения: гормон роста — соматотропин — имеет в своем составе 191 аминокислоту, а гормон передней доли гипофиза пролактин — 199 аминокислот). Один из этих процессов всем очень хорошо известен: инсулин способен снижать количество глюкозы в крови. Дело в том, что большое количество сахара в крови чревато последствиями: излишний сахар может гликозилировать белки крови, например гемоглобин, из-за чего гемоглобин начинает хуже выполнять свои функции, то есть хуже транспортировать кислород и углекислый газ. При повышенном сахаре также изменяется вязкость крови.

Ну и чтобы читатель окончательно убедился, что повышенный сахар в крови — это плохо, предлагаю поискать в интернете выражение «диабетическая стопа». Мы постоянно получаем микроповреждения на стопе. При неконтролируемом сахарном диабете нарушается целостность сосудов конечностей, а чувствительность в этих зонах уменьшается. Что мы имеем на выходе? В микроповреждениях скапливается небольшое количество крови. И если обычную кровь бактерии не очень любят, так как там полно клеток, которые их убивают, то в ситуации со сладкой кровью ситуация меняется. В итоге мы получаем раны на ступнях, которые кишат бактериями, а так как чувствительность уменьшилась — человек даже не чувствует болевых ощущений.

Как же инсулин снижает количество глюкозы в крови? Вместе с кровью инсулин и глюкоза приходят к различным клеткам наших органов. Далее, гормон связывается с рецепторами на поверхности мембраны клеток. Это связывание запускает работуглюкозных транспортеров — большой группы мембранных белков, задача которых — перенести глюкозу через мембрану из внешнего пространства внутрь клетки. Также инсулин активирует превращение сладкой мономерной глюкозы в гликоген. Гликоген — это полимерная молекула, которая состоит из связанных между собой остатков глюкозы. Новое строение — новые свойства. Полимерная молекула несладкая и нерастворима в воде, а значит, не влияет на химические реакции, которые происходят вокруг. Полисахарид может спокойно лежать в сторонке до лучших времен. Именно в форме гликогена глюкоза долгое время хранится в организме, создавая запас на будущее. По аналогии с крахмалом у растений, гликоген может образовывать гранулы в цитоплазме. Как только клетке понадобится энергия, а свободной глюкозы не окажется «под рукой», связи в полисахариде разрежут ферменты и появится мономер.

При нарушениях в работе инсулиновой системы развивается сахарный диабет — хроническое заболевание эндокринной системы. Есть два типа сахарного диабета:

1-й тип: поджелудочная железа вырабатывает недостаточное количество инсулина;

2-й тип: взаимодействие клеток организма с инсулином нарушено (подробнее о диабете 2-го типа вы можете прочитать в новости Микрофлора кишечника влияет на предрасположенность к аутоиммунным заболеваниям, «Элементы», 24.04.2013).

Патологии в углеводном обмене представляют серьезную проблему современности. Количество больных сахарным диабетом растет каждый год. По данным ВОЗ, число людей с диабетом возросло со 108 миллионов в 1980 году до 422 миллионов в 2014-м. Только за 2015 год диабет унес жизни около 1,6 миллионов человек; для сравнения, в том же году в ДТП погибло примерно 1,3 миллионов человек (см.: 10 ведущих причин смерти в мире).

Примерно 10–15% случаев сахарного диабета — то есть примерно 40 миллионов человек по всему миру — приходятся на диабет 1-го типа. Как уже говорилось, диабет 1-го типа возникает тогда, когда поджелудочная железа вырабатывает недостаточно инсулина. Это происходит из-за гибели бета-клеток поджелудочной железы. Причиной могут быть стресс, вирусные инфекции и аутоиммунные нарушения (которые возникают в том случае, когда иммунная система начинает воспринимать свои собственные клетки как врага и просто уничтожает их). Единственный выход для больных диабетом 1-го типа —пожизненные инъекции инсулина и соблюдение специальной диеты (при диабете 2-го типа достаточно просто соблюдать диету, потому что инсулин есть, но его требуется больше, чтобы клетки на него отреагировали).

Если снижать количество углеводов в рационе, остается больше инсулина для воздействия на клетки. Для диабетиков разработаны специальные таблицы (рис. 2), благодаря которым они подсчитывают необходимое количество инсулина для инъекций. Диетологами была предложена единица измерения — хлебная единица, или ХЕ. Одна ХЕ — это примерно 10-12 грамм усвояемых углеводов; например, один кусок белого хлеба весом 20 г — это одна хлебная единица. Сейчас уже существуют мобильные приложения, которые облегчают подсчет.

Рис. 2. Таблица хлебных единиц

Количество инсулина рассчитывается врачом индивидуально, однако больному важно соблюдать диету: если он употребил углеводов больше или меньше нормы, то сам может скорректировать количество инсулина. Когда доза инсулина подсчитана, необходимо сделать инъекцию. Укол делается в кожную складку, так чтобы инсулин оказался в жировой клетчатке (рис. 3), откуда он постепенно переместится в кровь.

Рис. 3. Схема подкожного введения инсулина

Места для инъекций могут быть различными: живот, бедро, плечо и т. д. Однако, надо учитывать, что скорость всасывания инсулина в разных местах разная (рис. 4).

Рис. 4. Области для инсулиновых инъекций с указанием скорости всасывания

Но где взять инсулин для инъекций? В начале XX века для этого использовался коровий инсулин, который отличается от человеческого на несколько аминокислот, но тем не менее способен снижать уровень глюкозы в крови. (подробнее об этом открытии см.: История одной молекулы). С развитием генной инженерии коровий инсулин был заменен человеческим, который синтезируется кишечной палочкой или дрожжами. Если коротко, то ген человеческого инсулина вставляют в ДНК E. coli или дрожжей. Методом селекции отбираются те клетки, в которые ген удачно встроился. Затем их выращивают на питательной среде, они размножаются, спокойно и неприхотливо помимо своих белков синтезируют человеческий инсулин. В конечном итоге клетки разрушают, а полученную смесь очищают. Человеческий инсулин готов! Такой способ получения используется и в наши дни. (подробнее о том, как переносят гены, см.: «Редакторы геномов». От «цинковых пальцев» до CRISPR).

И хотя проблема с получением инсулина для инъекций была решена, такая терапия не всегда бывает удачной: больные могут пропускать уколы из-за боязни игл или болевых ощущений во время введение шприца, особенно если речь идет о детях. Кроме того, если неправильно рассчитать необходимое количество инсулина и ввести значительно больше, может наблюдаться гипогликемия — состояние, когда количество глюкозы в крови снижается до критического (ниже 2,2–2,8 ммоль/л). В этом состоянии у человека начинается тремор, повышается давление, наблюдается общая слабость и нарушение сознания. Самый плохой исход — кома и даже смерть. Именно поэтому поиск альтернативного пути доставки инсулина является актуальной проблемой.

Выходом из положения было бы употребление инсулина перорально (через рот). Однако, желудочно-кишечный тракт является барьером для такой доставки: соляная кислота в желудке денатурирует белковые молекулы, ферменты в кишечнике расщепляют белки до аминокислот, а эпителиальные клетки, из которых состоят ворсинки тонкой кишки, всасывают только небольшие молекулы. Помимо этого, ворсинки покрыты слоем слизи, затрудняющий всасывание.

Исследователи из Гарвардского университета (США) и Калифорнийского университета в Санта-Барбаре разработали на основе ионной жидкости препарат для доставки инсулина через желудочно-кишечный тракт, который сможет помочь больным диабетом 1-го типа.

Что такое ионная жидкость и для чего она нужна?

Белковые молекулы не особенно стабильны: им нужны определенные условия, чтобы они не сворачивались в неправильные формы. При нарушении условий хранения белок может стать неактивным. И тут на помощь приходит ионная жидкость, которую последнее время часто используют в качестве растворителя. Как можно догадаться из названия, ионные жидкости состоят из ионов: катионов и анионов. По сути, это соли в жидком состоянии. Комплекс лекарства с ионной жидкостью делает его хорошо растворимым в воде и позволяет ему оставаться в одной и той же активной форме. Так как инсулин является белком, в своей работе ученые смешивали инсулин в ионной жидкости, состоящей из холина и гераниевой кислоты (см. Geranic acid), рис. 5 — эти ингредиенты, по мнению Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (Food and Drug Administration), безопасны для людей. Этот состав уже успел хорошо себя зарекомендовать: в предыдущих исследованиях этой же научной группы было показано, что именно комплекс холин — гераниевая кислота улучшает проникновение лекарства в кожу почти в 5 раз (M. Zakrewsky et al., 2014. Ionic liquids as a class of materials for transdermal delivery and pathogen neutralization) Ворсинки кишечника, так же как и кожа, состоят из эпителиальной ткани, поэтому было принято решение разработать препарат для перорального приема на основе ионной жидкости.

Рис. 5. Слева — гераниевая кислота, C₁₀H₁₆O₂; справа — холин, C₅H₁₄NO. Из статьи: M. Zakrewsky et al., 2014. Utilization of Ionic Liquids for Pathogen Neutralization

Для преодоления первого препятствия — кислой среды желудка — препарат из инсулина в ионной жидкости был помещен в капсулу с кислостойким покрытием (рис. 6), которое уже давно используется в фармакологии. Такое покрытие растворяется, когда капсула попадает в щелочную среду кишечника, в результате чего ионная жидкость и инсулин высвобождаются.

Рис. 6. Капсулы с инсулином в ионной жидкости для перорального приема (для крыс). Вместимость капсулы — 0,025 мл, внешняя длина — 8,4 мм. Фото из дополнительных материалов к обсуждаемой статье в PNAS

Как уже говорилось ранее, следующее препятствие — ферменты в кишечнике, которые расщепляют белковые молекулы. Оказалось, что ионная жидкость защищает инсулин от действия ферментов, что позволяет молекуле инсулина оставаться в неизменном виде. Помимо этого, комплекс холин — гераниевая кислота способен разжижать слизь кишечника, тем самым облегчая всасывание препарата.

Последний барьером являются сами эпителиальные клетки кишечника. Дело в том, что эти клетки выполняют транспортную и барьерную функцию, поэтому они способны пропускать одни вещества и задерживать другие. Выборочную проницаемость обеспечивают мембраны клеток, в которые встроены белки, пропускающие определенные молекулы. Например, аминокислоты переносятся через белки-транспортеры. В присутствие ионов натрия аминокислота связывается с белком, тот изменяет свою форму и пропускает молекулу внутрь. Для каждого вида молекул существуют свои транспортные белки. Нет белка — нет транспорта. Для инсулина в тонком кишечнике нет таких белков, потому что в норме он попадает из поджелудочной железы сразу в кровоток. Однако, между клетками есть небольшие промежутки, через которые осуществляется так называемый парацеллюлярный транспорт (см. Paracellular transport). Как правило, такой проход открыт для ионов и гидрофильных молекул, но не для таких крупных молекул, как инсулин. Однако ионная жидкость делает весь комплекс гидрофильным, поэтому молекула легко проходит и через этот барьер. Пройдя через слой клеток, инсулин попадает в кровь.

Как отмечают сами исследователи, их подход подобен швейцарскому ножу, где у одного лекарства есть все инструменты для устранения каждого из препятствий.

Еще одним явным плюсом этого препарат является то, что его изготовление не требует много вложений, а лекарство достаточно стабильно и может храниться при комнатной температуре в течение двух месяцев — это значительно больше сроков хранения инсулина для инъекций. Чтобы проверить, меняется ли форма белка при длительном нахождении в ионной жидкости, ученые хранили образцы препарата при комнатной температуре и при температуре 4°C. На протяжение четырех месяцев с помощью метода спектроскопии кругового дихроизма сравнивались свежеприготовленные образцы и те, которые хранились. Всё это время структура инсулина оставалась неизменной (рис. 7).

Рис. 7. График, построенный на основе результатов метода спектроскопии кругового дихроизма. Хорошо видно, что инсулин оставался в одной и той же альфа-спиральной конформации в течение всего периода хранения. По оси у — mdeg (милиградус поворота поляризованного света), по оси х — длина волны в нм. Изображение из обсуждаемой статьи в PNAS

Биологическую активность препарата проверяли на самцах крыс: им делали инъекции с образцами с разным сроком хранения, а затем проверяли уровень глюкозы в крови — он снижался одинаково. Также исследователи проверили эффективность перорального приема. Крысам давали готовые капсулы размера 9 (вместимостью 0,025 мл и длиной 8,4 мм), а затем измеряли уровень глюкозы в их крови. Через два часа после приема капсулы уровень глюкозы снизился на 38%, а спустя 10 часов — на 45%.

Чтобы удостовериться, что капсулы с ионной жидкостью биосовместимы с тканями тонкого кишечника, были приготовлены гистологические препараты. Крыс, которые получали капсулы, вскрыли, изъяли тонкий кишечник и приготовили серию срезов. Срезы были окрашены гематоксилином и эозином — классическими красителями для гистологических препаратов (см. Окраска гематоксилином и эозином). Изменений в морфологии кишечника не было, а ворсинки были обнаружены на всех срезах.

На этом плюсы не заканчиваются. Исследователи отмечают, что именно пероральная доставка, в отличие от инъекций, имитирует физиологический путь инсулина. В организме инсулин из поджелудочной железы переносится через воротную вену в печень, где примерно 80% гормона удерживается и только оставшаяся часть попадает в кровь. Инсулин, введенный подкожно, попадает в кровь неравномерно и с разной скоростью в зависимости от места укола.

Попытки изобрести препарат для доставки инсулина через желудочно-кишечный тракт начались много десятилетий назад. Было разработано несколько стратегий для преодоления препятствий, однако до сегодняшнего дня еще ни один из подходов не позволил создать дешевое и не токсичное лекарство, справляющееся со всеми препятствиями. Например, австрийские ученые предложили комплекс, в состав которого входят белки, останавливающие действие ферментов в кишечнике. (A. H. Krauland et al., 2004. Oral insulin delivery: the potential of thiolated chitosan-insulin tablets on non-diabetic rats). Однако, ингибиторы ферментов могут вызывать побочные эффекты, такие как интоксикация и гипертрофия поджелудочной железы.

Японские ученые предложили таблетку, покрытую тремя оболочками, которая растворяется только в толстом кишечнике, где ферменты, разрушающие белки до аминокислот, уже не так активны. (M. Katsuma et al., 2006. Effects of absorption promoters on insulin absorption through colon-targeted delivery). Однако площадь толстого кишечника меньше, чем тонкого, и в нем меньше воды, поэтому он не так хорошо подходит для всасывания лекарственных препаратов.

Многие предложенные лекарства требуют больших затрат на производство или имеют сложную рецептуру. Таким образом, рассмотренный в данной статье препарат является наиболее предпочтительным для массового производства: он эффективен, долго хранится, легок в приготовлении, безопасен и достаточно дешев. Исследователи планируют продолжать работу и надеются получить одобрение на клинические испытания с участием людей.

Источник: Amrita Banerjee, Kelly Ibsen, Tyler Brown, Renwei Chen, Christian Agatemor, and Samir Mitragotri. Ionic liquids for oral insulin delivery // PNAS. June 25, 2018. https://doi.org/10.1073/pnas.1722338115.

Анастасия Пашутова