Полимерные наночастицы — новое оружие в борьбе с бактериями?

Рис 1. Синтезированные в ходе исследования сферические (a) и стержнеобразные (b) полимерные молекулярные щетки имитируют два основных мотива структуры бактериофага. Их химическое строение приведено на схемах c и d. Синие цепочки на изображениях a и b и синие фрагменты структурных формул на схемах c и d соответствует поли(4-винил-N-метилпиридиниййодиду); красные элементы и фрагменты структурных формул соответствуют β-циклодекстрину (для a и c) и поли[2-(бромизобутирил)этилметакрилату] (для b и d). Рисунок из обсуждаемой статьи в ACS Infectious Diseases

Полимерные наночастицы, имитирующие строение оболочки вирусов, могут селективно убивать различные типы бактерий (включая штаммы, выработавшие резистентность к антибиотикам), не воздействуя на клетки человека. Варьирование размеров и формы наночастиц меняет их специфическую активность. Результаты исследования могут стать основой для новой стратегии разработки противомикробных препаратов, которые будут бороться с инфекциями, не способствуя развитию у бактерий резистентности.

Устойчивость организмов к действию антибиотиков — антибиотикорезистентность — в настоящее время является одной из наиболее серьезных проблем здравоохранения. В докладе Всемирной организации здравоохранения, опубликованном в апреле 2014 года, сказано следующее: «Резистентность уже не представляет собой лишь прогноз на будущее, поскольку она уже проявляется прямо сейчас в каждом регионе мира и может отрицательно сказаться на каждом, независимо от возраста, в каждой стране. Устойчивость к антибиотикам — явление, когда бактерии меняются настолько, что антибиотики больше не оказывают никакого воздействия на организм людей, которые нуждаются в них для борьбы с инфекцией, и это сейчас одна из серьезнейших угроз для здоровья людей» (подробнее о том, чем опасна устойчивость бактерий к антибиотикам, можно прочитать в статье Антибиотиковый апокалипсис). Конечно, прогресс в области создания новых антибиотиков тоже не стоит на месте, регулярно сообщается о создании препаратов, устойчивость к которым у бактерий вырабатывается очень медленно (см., например, новость Синтезирован суперантибиотик, к которому не вырабатывается резистентность, «Элементы», 06.06.2017), однако стратегии, применяющиеся для разработки противомикробных препаратов, увы, не блещут разнообразием. К ним относятся блокировка механизмов, управляющих строительством клеточной мембраны бактерии, нарушение работы бактериальной рибосомы, отвечающей за процессы белкового синтеза, или нарушение репликации бактериальных ДНК. К сожалению, каким бы мощным ни был новый антибиотик, рано ли поздно естественный отбор приводит к тому, что появляются штаммы бактерий, устойчивые и к его воздействию. К механизмам защиты, которые вырабатываются у бактерий, могут относиться биохимическая модификация антибиотика, снижающая его активность, изменение бактерией молекулярной мишени, на которую воздействовал антибиотик, или активное выведение лекарственного препарата из клетки бактерии.

Решая задачу разработки новых противомикробных препаратов, исследователи пытаются изобретать новые типы стратегий — получать системы, способные в прямом смысле разрывать на части бактериальные клетки, не давая им времени на выработку резистентности. Один из таких перспективных подходов — применение антимикробных пептидов (antimicrobial peptides). Это короткие цепочки, состоящие из аминокислотных остатков, вырабатываемые различными организмами для защиты от биологических патогенов (бактерий, паразитов или грибков). Действие антимикробных пептидов основано на их встраивании в клеточную мембрану патогенного организма, нарушении структурной целостности мембраны и, как следствие, разрушении клетки.

Ранее были получены противомикробные наночастицы из антимикробных пептидов природного происхождения (см., например, G. N. Tew et al., 2010. De novo design of antimicrobial polymers, foldamers, and small molecules: From discovery to practical applications), а также из полимеров, моделирующих эти пептиды (E. F. Palermo, K. Kuroda, 2010. Structural determinants of antimicrobial activity in polymers which mimic host defense peptides). Однако наночастицы и из белков, и из имитирующих их строение синтетических полимеров имеют общий недостаток: их гидрофобные фрагменты разрушают также и оболочки клеток млекопитающих. Это ограничивает возможность применения таких систем в качестве антибиотиков.

Исследователи из группы Хунцзюня Ляна (Hongjun Liang) из Техасского технологического университета предположили, что большую избирательность в борьбе с бактериями могут продемонстрировать не имеющие гидрофобных фрагментов белки бактериофагов — вирусов, избирательно поражающих бактериальные клетки. Точнее, не сами белки бактериофагов, а их синтетическая модель.

Исследователи получили три наночастицы, имитирующие строение бактериофагов: сферу диаметром 8 нанометров и два стержня диаметром 7 нанометров и длиной один 18, другой — 70 нанометров. Для синтеза полимерных наноструктур на первом этапе использовалась блок-сополимеризация: к β-циклодекстрину (эта структура служила основой для наночастиц сферической формы) или поли[2-(бромизобутирил)этилметакрилату] (этот полимер был основой для стержневидных наночастиц) прививали нити поли(4-винил-N-метилпиридина). Полученные блок-сополимеры, содержащие в обрамляющих группах пиридиновые фрагменты, на втором этапе получения наночастиц подвергли модификации, обработав йодметаном. Произошла реакция кватернизации (в этой реакции незаряженный трехвалентный атом азота (реже фосфора) реагирует с чем-либо (чаще всего с кислотой или алкилгалогенидом), превращаясь в четырехвалентный азот, несущий положительный заряд, который уравновешивается отрицательным зарядом кислотного остатка или галогенид-иона из состава алкилгалогенида; см. Quaternary ammonium cation), которая позволила превратить метилпиридиновые фрагменты в солевые метилпиридиниййодидные группы.

Выбор форм и размеров наночастиц был продиктован желанием смоделировать структурные мотивы некоторых элементов бактериофагов; так, например, хвостовая трубка бактериофага T4 характеризуется длиной 94 нм и диаметром 9,6 нм. Наночастицы состоят из полимерного ядра, обрамленного «ворсинками» из несущего положительный заряд гидрофильного полимера — поли(4-винил-N-метилпиридиниййодида) (рис. 1). Гидрофильность (то есть способность образовывать прочные межмолекулярные взаимодействия с водой) фрагментов полимера, окружающих ядро, достигается благодаря наличию ионной химической связи между катионом пиридиния (пиридиний — ионное производной пиридина) и йодид-анионом в составе структурных звеньев внешней оболочки полученных полимерных частиц. Вода — полярный растворитель, который с помощью нехимических связей образует прочные ассоциаты с заряженными фрагментами полимера.

Все три типа наночастиц были испытаны на активность по отношению к грамотрицательным штаммам Escherichia coli (рис. 2), грамположительным штаммам Staphylococcus aureus, проявляющему устойчивость к целому ряду антибиотиков штамму Pseudomonas aeruginosa, а также на цитотоксичность в отношении красных кровяных клеток человека. Эксперименты показали, что наиболее эффективно работают сферические наночастицы. Чтобы убить 99,9% грамотрицательной E. coli, нужно не более 32 мкг/мл наночастиц такого типа, а их концентрация, смертельная для грамположительного S. aureus, составляет 4 мгк/мл. Наконец, для уничтожения 99,9% клеток устойчивой к широкому набору антибиотиков P. aeruginosa достаточно концентрации лишь 2 мкг/мл.

Рис. 2. Полученные с помощью сканирующего электронного микроскопа изображения бактерий E. coli. c — контрольный образец, d–f — образцы, инкубированные с наночастицами: длинным стержнем (d), коротким стержнем (e) и сферой (f). Нарушение целостности оболочки бактерий проявляется уже через 200 секунд после начала инкубации E. coli со сферическими наночастицами и с наночастицами, представляющими собой короткий стержень. Рисунок из обсуждаемой статьи в ACS Infectious Diseases

Стержнеобразные частицы проявляли меньшую противомикробную активность. Для наностержня с длиной 70 нм минимальная бактерицидная концентрация по отношению к двум различным грамположительным штаммам S. aureus была не менее 512 мкг/мл. Это очень высокая концентрация, которая фактически исключает использование наночастиц этого типа в качестве бактерицидов в борьбе с грамположительными микробами: в такой концентрации наночастицы слишком вредны для организма (в первую очередь, для его фильтрующих органов, таких как печень и почки) и дороги для массового применения. Зато наностержни опасны для грамотрицательных бактерий: минимальная бактерицидная концентрация для грамотрицательной P. aeruginosa составляет 2 и 4 мкг/мл для наностержней с длиной 18 и 70 нм соответственно.

Избирательность по отношению к грамотрицательным бактериям связана с тем, что грамположительные бактерии обладают плотной пептидогликановой оболочкой, поры которой с диаметром от 5 до 50 нм малопроницаемы или непроницаемы для стержнеобразных наночастиц; вместе с тем те же наностержни вполне способны повредить тонкую внешнюю липидную оболочку грамотрицательных бактерий. Предполагается, что полученные результаты могут оказаться полезными для управления активностью и селективностью бактерицидной наночастицы за счет изменения ее размеров или/и формы.

Проведенные эксперименты также показали, что все три наночастицы безопасны для эритроцитов человека, они не вызывают ни разрушение их мембраны, ни их агглютинацию (слипание). Разное отношение к клеткам разных типов объясняется разницей в строении мембран этих клеток. Состоящая преимущественно из неполярных и гидрофобных фосфолипидов оболочка эритроцитов человека не должна взаимодействовать с полярными наночастицами, следовательно они не смогут встроиться в оболочку и нарушить ее целостность либо связаться с оболочкой сразу двух и более эритроцитов и вызвать их слипание. В состав клеточных мембран бактериальных клеток входят сфинголипиды, в них в заметном количестве присутствуют полярные фрагменты — фосфохолиновый (см. Phosphocholine) или фосфоэтаноламиновый (см. Phosphorylethanolamine), — с которыми и связываются гидрофильные полимеры, образующие оболочку наносфер или наностержней.

Пока еще преждевременно говорить о клиническом применении бактерицидных наночастиц, однако исследователи надеются, что результаты их работы позволят на глобальном уровне изменить подходы к борьбе с патогенными микроорганизмами. Их работа может стать основой для создания нового класса антибиотиков — «наноантибиотиков», направленный дизайн строения которых сделает возможным управление активностью, селективностью и биологической совместимостью наночастиц, проявляющих бактерицидные свойства.

Источник: Yunjiang Jiang, Wan Zheng, Liangju Kuang, Hairong Ma, Hongjun Liang. Hydrophilic Phage-Mimicking Membrane Active Antimicrobials Reveal Nanostructure-Dependent Activity and Selectivity Selectivity // ACS Infectious Diseases. 2017. DOI: 10.1021/acsinfecdis.7b00076.

Аркадий Курамшин