Рибозимы могут размножать друг друга

Рис. 1. Схематическое изображение нового рибозима (tC19 или tC19Z) и его «достижений». Рисунок из синопсиса к обсуждаемой статье в Science
Рис. 1. Схематическое изображение нового рибозима (tC19 или tC19Z) и его «достижений». Рибозим работает с матрицей (молекулой РНК, которую нужно копировать; серые шарики) с заранее приделанным праймером (черные шарики). Начиная от праймера, рибозим синтезирует на матрице комплементарную ей цепочку РНК, присоединяя нужные нуклеотиды по одному (разноцветные шарики). В результате могут быть скопированы молекулы РНК длиной до 95 нуклеотидов (справа вверху), в том числе активный рибозим Mini-hammerhead (справа внизу), который умеет разрезать в определенном месте молекулы РНК с определенной последовательностью нуклеотидов (розовые шарики). Рисунок из синопсиса к обсуждаемой статье в Science

Согласно теории РНК-мира, на заре жизни должны были существовать рибозимы (молекулы РНК с каталитическими свойствами), способные осуществлять матричный синтез (размножение) молекул РНК. В природе такие рибозимы не обнаружены, а созданные искусственно работают очень плохо. Сочетая методы «эволюции в пробирке» и «разумного дизайна», американские ученые изготовили улучшенный рибозим с РНК-полимеразной активностью, способный копировать молекулы РНК длиной до 95 нуклеотидов (прежний рекорд – 20). При помощи нового рибозима впервые удалось осуществить размножение функциональной молекулы РНК (другого рибозима) без участия белков-ферментов.

Ключевым компонентом РНК-мира предположительно были молекулы РНК с РНК-полимеразной активностью, то есть рибозимы, катализирующие репликацию (размножение) молекул РНК. Без таких рибозимов в мире РНК была бы невозможна настоящая наследственность и дарвиновская эволюция. У современных живых организмов такие рибозимы не обнаружены: по-видимому, они давно вытеснены более эффективными белковыми ферментами-полимеразами. Поэтому для того, чтобы реконструировать ранние этапы зарождения жизни, а заодно и окончательно доказать возможность существования устойчивого и способного к дарвиновской эволюции мира РНК, очень важно получить такой рибозим искусственно.

Ученые бьются над этой задачей уже более 10 лет, применяя попеременно то метод искусственной эволюции (случайные мутации + отбор удачных вариантов), то сознательное проектирование. Оба метода сталкиваются с серьезными трудностями. Возможности «разумного дизайна» ограничены отсутствием надежных методов предсказания каталитических свойств рибозимов по их первичной структуре (последовательности нуклеотидов). Для эффективной «искусственной эволюции» нужно научиться каким-то образом выбирать из огромного множества слегка различающихся молекул ту, которая лучше всех справляется со своей задачей, в данном случае — с копированием молекул РНК (см.: Эволюция под управлением компьютера, «Элементы», 12.04.2008). Это непросто, потому что те рибозимы-полимеразы, которые удалось получить на сегодняшний день, не могут размножать сами себя (в этом случае проблема отбора была бы решена: какого рибозима в пробирке окажется больше, тот и «победитель»). Речь пока идет только о копировании фрагментов других молекул РНК (матриц), причем не любых, а со строго определенной нуклеотидной последовательностью. Если просто поместить в пробирку миллион разных рибозимов, то как потом узнать, какой из них насинтезировал больше копий матрицы?

Правда, уже известны рибозимы, способные катализировать свой собственный синтез, но не из отдельных нуклеотидов, а из целых больших кусков РНК — олигонуклеотидов. Такие рибозимы действительно могут сами себя размножать, но в качестве «пищи» (исходного субстрата) им необходимы, по сути дела, их собственные крупные фрагменты (см.: Тайна происхождения жизни скоро будет разгадана?, «Элементы», 12.01.2009).

Что касается настоящих рибозимов-полимераз, которые синтезируют на матрице РНК комплементарную молекулу из отдельных нуклеотидов, то до сих пор лучшее, что удалось создать ученым, — это рибозим R18.

Рис. 2. Рибозим R18 (слева) и его улучшенные варианты. Рисунок из обсуждаемой статьи в Science
Рис. 2. Рибозим R18 (слева) и его улучшенные варианты. Рисунок из обсуждаемой статьи в Science

Этот рибозим использует в качестве матрицы одноцепочечную молекулу РНК с заранее подготовленной «затравкой» (праймером). Праймер — это небольшой кусочек комплементарной цепи РНК, присоединенный к одному из концов матрицы (рис. 1). Рибозим R18 достраивает комплементарную цепь, начиная от праймера. Максимум, чего от него можно добиться, — это присоединения 15–20 комплементарных нуклеотидов. Иными словами, если повезет, он может скопировать фрагмент молекулы РНК (матрицы) длиной до 20 нуклеотидов. В большинстве случаев, впрочем, процесс репликации РНК прерывается раньше. У R18 есть еще один недостаток: он копирует далеко не любую матрицу, а только весьма узкий круг нуклеотидных последовательностей. Эффективность работы R18 сильно зависит от нуклеотидной последовательности матрицы. Этим R18 радикально отличается от «настоящих», белковых полимераз, которые копируют любые матрицы с одинаковой эффективностью и которым совершенно всё равно, в какой последовательности расположены в матрице нуклеотиды.

Попытки радикально улучшить работу R18 до сих пор были безуспешны. Появились даже опасения, что R18 представляет собой «эволюционный тупик», что его в принципе нельзя усовершенствовать путем внесения небольших изменений и нужно искать что-то совсем другое. Надо сказать, что пространство для поиска невообразимо велико: рибозим R18 состоит из 189 нуклеотидов; общее число возможных молекул РНК такой длины равно 4189 ≈ 10114. Это на много порядков больше числа элементарных частиц во Вселенной. Перепробовать все эти варианты, разумеется, невозможно.

Новая работа американских молекулярных биологов, опубликованная в журнале Science, показала, что R18 всё-таки не является тупиком, и на его основе можно изготовить более эффективные РНК-полимеразы. Выяснить это позволила новая методика, благодаря которой удалось резко ускорить «искусственную эволюцию» рибозимов с полимеразной активностью. Суть методики в том, что ДНК-овые гены множества слегка различающихся рибозимов прикрепляют к крошечным магнитным шарикам, которые, в свою очередь, помещаются в водно-жировую эмульсию, так что каждый шарик со своим геном оказывается изолирован от остальных в маленькой водяной капле. В этой капле при помощи ферментов осуществляется транскрипция — синтезируется множество копий рибозима, после чего рибозимам дают возможность реплицировать РНК-матрицу. Затем следует еще несколько хитрых операций, в результате которых те шарики, на которых рибозимы поработали наиболее успешно, метятся флуоресцентными метками. Остается только извлечь ярко светящиеся шарики и выяснить (путем секвенирования прикрепленного к шарику гена), что за рибозим так хорошо справился со своей работой.

Эта замечательная методика (в сочетании с еще несколькими методологическими новшествами) позволила авторам перепробовать десятки миллионов модификаций исходного рибозима R18. Конечно, десятки миллионов — это исчезающе малая доля от устрашающего числа 10114. Тем не менее этого оказалось достаточно, чтобы найти варианты, справляющиеся с функцией РНК-полимеразы намного лучше, чем R18.

Отбор велся в двух направлениях. С одной стороны, отбирались рибозимы, способные наиболее эффективно копировать одну стандартную матрицу. Так был получен рибозим C19 (фигура B на рис. 2). Разобравшись в его структуре, авторы сумели внести в него дополнительные усовершенствования методом «разумного дизайна» и получили еще более эффективный рибозим tC19 (фигура C). После этого был проведен еще и отбор матриц: внося изменения в стандартную матрицу, авторы «вывели» такую ее модификацию, которую рибозим tC19 копирует наиболее эффективно. В результате удалось поставить рекорд: рибозим скопировал участок молекулы РНК длиной в 95 нуклеотидов. На сегодняшний день это самая длинная молекула РНК, синтезированная рибозимом из отдельных нуклеотидов.

В другой серии экспериментов авторам удалось, используя несколько разных матриц, вывести рибозим, полимеразная активность которого не так сильно зависит от нуклеотидной последовательности матрицы. Этот рибозим обозначили буквой Z (фигура D на рис. 2).

После этого ученые объединили полезные новшества, характерные для рибозимов tC19 и Z, в одной молекуле, и создали свой шедевр — рибозим tC19Z (фигура Е на рис. 2). В этом рибозиме соединились высокая полимеразная активность рибозима tC19 с повышенной универсальностью (низкой зависимостью от матрицы) рибозима Z.

Рибозим tC19Z способен копировать довольно широкий круг матриц, причем делает он это с меньшим числом ошибок, чем все выведенные ранее рибозимы-полимеразы. Исходный рибозим R18 делает в среднем 4,3 ошибок на 100 присоединенных нуклеотидов, tC19 работает точнее (2,7 неправильных или пропущенных нуклеотидов на сотню), tC19Z ошибается еще реже (0,88 ошибок на 100 нуклеотидов).

Чтобы наглядно продемонстрировать широкие возможности рибозима tC19Z, авторы успешно размножили с его помощью не специально созданную для этой цели и больше ни на что не годную матрицу, а настоящую функциональную молекулу РНК — другой рибозим, известный под названием Mini-hammerhead. Этот крошечный рибозим состоит всего из 24 нуклеотидов, но он обладает собственной каталитической функцией (эндонуклеазной активностью): он умеет разрезать РНК с определенной нуклеотидной последовательностью в одном строго определенном месте. Рибозим tC19Z успешно справился с копированием рибозима Mini-hammerhead. Тем самым впервые была продемонстрирована репликация функциональной молекулы РНК при помощи рибозима-полимеразы.

Полученные авторами результаты — важный шаг на пути к созданию (или воссозданию?) полноценных рибозимов — РНК-полимераз, появление которых когда-то придало РНК-миру способность к дарвиновской эволюции. Можно надеяться, что разработанные авторами новаторские методы ускорят прогресс в понимании ранних этапов становления земной жизни.

Источник: Aniela Wochner, James Attwater, Alan Coulson, Philipp Holliger. Ribozyme-Catalyzed Transcription of an Active Ribozyme // Science. 2011. V. 332. P. 209–212.

См. также:
1) Эволюция под управлением компьютера, «Элементы», 12.04.2008.
2) Происхождение жизни (глава из книги А. Маркова «Рождение сложности»).
3) Тайна происхождения жизни скоро будет разгадана?, «Элементы», 12.01.2009.

Александр Марков


21
Показать комментарии (21)
Свернуть комментарии (21)

  • Александр Марков  | 13.04.2011 | 19:44 Ответить
    там вместо значка "приблизительно равно" получилась точка, надо исправить
    Ответить
    • editor > Александр Марков | 14.04.2011 | 02:17 Ответить
      Спасибо, исправили.
      Ответить
  • Rattus  | 13.04.2011 | 22:21 Ответить
    Как давно я ждал такого подробного разбора состояния вопроса по рибозимам РНК-полимеразам. Со времени той статьи про рибозимы РНК-лигазы от 12.01.2009 и даже раньше.

    Картина оказалась не совсем такой, как думалось ранее, но возникшие тогда вопросы так и остались:

    Если жизнь - это именно _самокопирование_, то почему так мало внимания уделяется первой части этого слова? I.е. само-, а точнее взаимо-специфичности искомого рибозима (понятно, что в процессе копирования необходима денатурация вторичной струтуры РНК, а значит - хотя бы временная, но утеря каталитической функции самой копируемой молекулы).
    Ведь неспецифичный репликатор будет копировать весь рядомплавающий полинуклеотидный мусор без разбору. Вариант одновременного образования многомолекулярного комплекса, где одни молекулы, например, будут распознавать своих, другие синтезировать на них олигонуклеотиды, а третьи лигировать получившиеся куски и т.п. - маловероятна во первых: из-за высокой сложности, а во вторых: из-за нелокализованности в пространстве. Чтобы постоянно держать их все вместе или хотя бы изолировать неспецифичные репликаторы (как предполагается, возможно лишь для образовательной наглядности, вот тут: http://exploringorigins.org/fattyacids.html ) уже нужна протоклетка. А это, как мне кажется, еще менее вероятно.

    Или придать самоспецифичность и отвязать полимеразу от затравок технически гораздо менее сложная проблема, чем достижение уровня процессивности не менее размера самой полимеразы?
    Ответить
    • SysAdam > Rattus | 14.04.2011 | 15:18 Ответить
      Возможно, раньше просто существовали РНК с разной хиральностью, которые взаимно себя копировали? А Затем РНК одной хиральности научились делать белки, и РНК с другой хиральностью им стали не нужны? Поэтому в нашем органическом мире представлена молекулярные структуры практически только однорукие?
      Ответить
      • Александр Марков > SysAdam | 14.04.2011 | 15:46 Ответить
        рибозимы-полимеразы могли образовывать некие циклы взаимного размножения. И они, похоже, все-таки были избирательными. В рибозимах C19, tC19 и tC19Z есть фрагмент, обозначенный на рисунке ssC19 (UCAUUG). Это последовательность, служащая для распознавания матрицы. Эти рибозимы реплицируют только матрицы, содержащие фрагмент, комплементарный этой последовательности. Там еще написано, что ситуация напоминает то, как рибосомы работают с мРНК.
        Ответить
        • Rattus > Александр Марков | 14.04.2011 | 16:21 Ответить
          Ага, вот вижу. Премного благодарствую за уточнение.
          Но, судя по статье, исследователи это считают вредным свойством?!
          Или это потому, что с такой специфичностью исключается возможность любых неповреждающих мутаций и => материала для начала эволюции? Как-то очень сомнительно.

          >Там еще написано, что ситуация напоминает то, как рибосомы работают с мРНК.

          А мне эти рибозимы напомнили вироиды - своим размером. Длина известных вироидов находится в пределах ~200-400 нт.: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/GenomesGroup.cgi?taxid=12884&opt=Viroid Хотя их задача ограничивается только инициацией своей репликации вполне уже белковой клеточной РНК-полимеразой, кажется вероятным, что искомый рибозим должен иметь размер также в области ~200 нт.
          Ответить
        • olegov > Александр Марков | 06.06.2011 | 21:55 Ответить
          Мне кажется наоборот изначально были гиперциклы, а молекулы каталитических РНК отобрались как воспроизводящие гиперциклы, которые снабжали их необходимыми веществами. Те РНК, что не могли собрать основные гиперциклы и самих себя отсеивались отбором.
          Ответить
      • Rattus > SysAdam | 14.04.2011 | 15:52 Ответить
        Тоже как-то маловероятно. Вообще проблема хиральности мне кажется по большей части надуманной: зеркально-симметричные молекулы, AFAIK, одинаковы по химической активности, а победили одни а не другие просто из-за случайной флюктуации, ведь "должен остаться только один", а причина может быть самая любая. Короче: "кто первым встал, того и тапки". И случилось это, КМК, еще до белков. А когда дело дошло до аминокислот, то и там все должно было решиться также - случайно и достаточно быстро.

        Мне более вероятным видится такой вариант: рабочая последовательность самоспецифичной РНК-полимеразы в первом рибозиме-саморепликаторе должна быть в виде двух инвертированных повторов на одной молекуле, разделенных некодирующим (точнее - каталитически неактивным) участком последовательности. Тогда в одной молекуле будет два активных центра, которые могли бы, в принципе, копировать друг друга по очереди, передавая эстафету другому на этом некодирующем куске. Как на картине Эшера "рисующие руки".
        Ответить
        • SysAdam > Rattus | 14.04.2011 | 16:05 Ответить
          Почему "должен был остаться только один"? "Боливар не вынесет двоих"? А какие ограничивающие факторы? Вот РНК одной хиральности изобрели белки, и как реликтовые прогрессоры подчинили себе варварские племена.
          Ответить
          • Rattus > SysAdam | 14.04.2011 | 16:35 Ответить
            >Почему "должен был остаться только один"?

            А другие нуклеотиды на момент появления первого саморепликатора просто некому включать в оборот. А время от появления самоспецифичной полимеразы до протоклетки и в них - рибозимов или даже метаболических путей, способных "перековывать" "неправильные" молекулы в "правильные" Нам кажется гораздо меньшим, чем от первых полирибонуклотидов до первого саморепликатора, ибо эволюция уже стартовала.
            Т.е. зеркальным полинуклеотидам просто не хватит времени до появления своего "ответа Чемберлену".
            Ответить
            • SysAdam > Rattus | 14.04.2011 | 17:01 Ответить
              Следовательно, Вы предполагаете, что саморепликаторы появились в одной луже на новоделанной Земле, и в других лужах они появится не успевали (в силу очень маленькой вероятности такого события) за то время, пока первые саморепликаторы развиваются до уровня тотального пожирания уже всего "непрофильного"?
              Ответить
              • Rattus > SysAdam | 14.04.2011 | 20:42 Ответить
                >Вы предполагаете, что саморепликаторы появились в одной луже на новоделанной Земле

                В одной Очень Большой Луже.

                >в силу очень маленькой вероятности такого события

                Хе. Хехе. А ведь действительно оно не такое уж маловероятное должно же быть фпринцыпе. И лужа действительно весьма большая...

                >за то время, пока первые саморепликаторы развиваются до уровня тотального пожирания уже всего "непрофильного"

                Ну а почему нет? Нам таки кажется, что после начала уже гораздо меньше времени на развитие этого надо.
                Ответить
                • SysAdam > Rattus | 16.04.2011 | 11:51 Ответить
                  "В одной Очень Большой Луже."
                  Очень сомневаюсь в том что в ОБЛ можно обеспечить достаточную концентрацию. Больше поверю в лужи, которые оставались от кислотных дождей того времени, которые постепенно пересыхали. Кстати, рост концентрации при пересыхании мог задавать некую разновидность направленного отбора.

                  "Хе. Хехе. А ведь действительно оно не такое уж маловероятное должно же быть фпринцыпе. И лужа действительно весьма большая..." Вот-вот. Вопросы по вероятности есть. А вот большой размер как раз не должен бы иметь значение, и даже вредить. Но если шли дожди, и возникали пересыхающие лужи, то много мелких повторяющихся луж могли породить. Тут бы оценить доверительный интервал между зарождениями и скорость развития до стадий подавления "чужих" (если не так патетично, то просто использования всего подходящего как строительный материал)

                  "Ну а почему нет? Нам таки кажется, что после начала уже гораздо меньше времени на развитие этого надо."
                  А мне не кажется. Я могу предположить что такое возможно, но вот расчетов более-менее правдоподобных нет.
                  Так что и обратное вполне могу предположить.
                  Ответить
      • Rattus > SysAdam | 14.04.2011 | 15:52 Ответить
        --
        Ответить
  • Ka  | 13.04.2011 | 23:21 Ответить
    Статья хорошая, и все бы замечательно, но вот за фразы типа "фигура В на рисунке таком-то" мне стыдно. Уж если на Элементах русский язык не знают, албанский - наше будущее...
    Ответить
    • Rattus > Ka | 14.04.2011 | 08:24 Ответить
      "Cyrillics - eta nekulturna!"
      Ответить
    • Kuzia > Ka | 16.04.2011 | 16:35 Ответить
      О чем Вы? В этой фразе нет ничего, что резало бы слух.
      Ответить
      • Ka > Kuzia | 17.04.2011 | 13:40 Ответить
        Слово "фигура" в русском языке этого значения не имеет, если сомневаетесь, посмотрите, например, словарь Ушакова (я как раз только что это проверил :) ). Фраза "фигура B на рис. 2" похожа на какой-то англицизм, да и то кривой; должно быть "рис. 2В".
        Ответить
        • Kuzia > Ka | 17.04.2011 | 15:48 Ответить
          Сомневаюсь и потому посмотрел в Дале: http://slovardalja.net/word.php?wordid=42038 : "Фигура геометрическая, очерк площади или тело, ограниченное плоскостями, чертеж."
          Употребление именно в этом контексте в первой пришедшей на память (и доступной on-line) книге:
          http://herba.msu.ru/shipunov/school/books/gurjanova1936_ravnonogie_dv.djvu
          Я могу с Вами согласиться, что сегодня так пишут (а тем более, говорят) нечасто, но это никак не проявление безграмотности.
          Ответить
          • Ka > Kuzia | 17.04.2011 | 16:36 Ответить
            Можно ли назвать изображение вторичной структуры молекулы РНК "фигурой геометрической, очерком площади или тела, ограниченного плоскостями, чертежом"? Сомневаюсь, по крайней мере, глаз режет сильно. К сожалению, программа просмотра Djvu у меня на компе отсутствует, поэтому о приведенной Вами в пример книге сказать ничего не могу. Не могу также сказать, что читаю много русскоязычной научной литературы. Однако, в тех книгах/статьях, что приходилось читать, такого оборота я никогда не видел.
            Ответить
  • Alex_V  | 02.05.2011 | 20:58 Ответить
    Фантазии продолжаются. В супе из топора откуда-то оказались популяции стандартных нуклеотидов. Похоже, их господь Бог подбирал в пробирке. А ведь комплементарность - понятие чисто математическое. Говорить о репликации и саморазмножении РНК смысла нет, ибо существует неограниченное число соединений, образующих 2 и 3 водородные связи со стандартными нуклеотидами. Напомню, что только нестандартных рибонуклеотидов в клетке 17, а дезоксирибонуклеотиды - это вообще другой набор. Так кто же все-таки установил искомый 4-х нуклеотидный стандарт и обеспечил его строгое соблюдение? Ведь одно только добавление правосторонних аналогов стандартных НК губит всю репликацию на корню.
    Ответить
Написать комментарий


Элементы

© 2005-2017 «Элементы»