Дарвиновские геммулы преодолели вейсмановский барьер

Рис. 1. Схематические изображения теории пангенезиса Дарвина (А) и теории о барьере Вейсмана (Б). Рисунок из книги Э. Стил, Р. Линдли, Р. Бландэн «Что, если Ламарк прав?», с незначительными изменениями

Итальянские ученые решили проверить, могут ли приобретенные признаки передаваться потомству посредством прямого переноса от соматических к половым клеткам специфических молекул РНК. Для этого мышам подкожно трансплантировали клетки меланомы человека со встроенным геном зеленого флуоресцирующего белка. Ожидания были оправданы: молекулы РНК чужеродного гена, нарабатывающиеся в трансплантированных клетках, обнаружились не только в крови подопытных животных, но и в их сперматозоидах. Таким образом, впервые наглядно продемонстрировано, что — как и предполагал Чарльз Дарвин в своей теории геммул и пангенезиса и вопреки теории о так называемом вейсмановском барьере — генетическая информация действительно может быть передана из соматических клеток в половые, по крайней мере в форме РНК.

В настоящее время признается существование двух уровней информации, на основе которых работают все живые клетки и многоклеточные организмы. Первый уровень — это генетическая информация (текст из четырех типов нуклеиновых оснований, кодирующий последовательности аминокислот в клеточных белках и хранящийся в хромосомах). С некоторой частотой в нуклеотидных последовательностях хромосом появляются изменения (мутации). Если эти мутации происходят в хромосомах половых клеток, то возникают вариации (аллели) генов, которые наследуются в соответствии с классическими законами Менделя.

Второй уровень — это эпигенетическая информация (обширный набор механизмов, определяющих условия, место и время считывания генетической информации). На основе эпигенетической информации осуществляется регуляция работы генов, и различия в этой регуляции серьезно влияют на фенотипические проявления одних и тех же генов у разных индивидуумов. Чтобы понять, насколько широки возможности эпигенетической информации, достаточно вспомнить, что все разнообразные клетки нашего организма, от клеток кожи до нейронов и эритроцитов, содержат одинаковые хромосомы с одинаковыми генами, а различаются исключительно эпигенетическими вариациями.

Изменения в эпигенетической информации (эпимутации) происходят гораздо чаще, чем в генетической. В основе эпимутаций лежат специфические химические модификации собственно ДНК (метилирование/деметилирование цитозинов) или связанных с ДНК белков — гистонов, а для осуществления этих химических модификаций в клетке работают специальные ферменты и регуляторы, включая как белки, так и особые регуляторные РНК. В сущности, именно на эпигенетической вариации и основана так называемая модификационная изменчивость, подразумевающая физиологически обусловленные приспособительные реакции организма на средовые воздействия.

Как постулировала догма синтетической теории эволюции, модификационная изменчивость не наследуется, ограничиваясь исключительно соматическими клетками, тканями и органами. Эта догма идет еще от Августа Вейсмана, который отвергал дарвиновскую теорию пангенезиса (согласно которой в клетках организма образуются особые мельчайшие частицы — геммулы, — несущие информацию о тех изменениях, которые клетки претерпели в течение жизни, и передающие ее с током крови в половые клетки; рис. 1, вверху) и настаивал на отсутствии каких-либо каналов коммуникации между соматическими и половыми клетками (так называемом «барьере Вейсмана»; рис. 1, внизу) и, как следствие, на принципиальной невозможности наследования приобретенных признаков.

Тем не менее уже с середины ХХ века было установлено, что некоторые эпимутации у растений склонны передаваться в длинной череде поколений (об одном из таких случаев см. Механизм неменделевской наследственности остается загадочным, «Элементы», 17.10.2007). Это явление назвали эпигенетической трансгенерационной наследственностью. Часто эпигенетическая природа наследования может быть опознана по неменделевскому характеру расщепления анализируемого признака в потомстве: носителей нового признака оказывается в потомстве больше, чем должно было бы быть по классической схеме генетического наследования. Еще один признак того, что мы имеем дело с эпимутациями, а не с истинными мутациями — что индуцированная специфическими условиями фенотипическая вариация постепенно «затухает» в ряду поколений, если индуцирующие условия в дальнейшем не поддерживаются. Более того, в течение последнего десятилетия накапливаются данные о существовании эпигенетической трансгенерационной наследственности и у животных, в том числе у млекопитающих (см., например, Устойчивое существование популяции обеспечивается негенетической «памятью поколений», «Элементы», 03.07.2007, и Наследственная информация записана не только в ДНК, «Элементы», 01.06.2006).

Пожалуй, наиболее впечатляющим из таких исследований можно признать статью Parental olfactory experience influences behavior and neural structure in subsequent generations, опубликованную в журнале Nature Neuroscience в начале 2014 года. В этом исследовании авторы вырабатывали у самцов мышей рефлекс избегания по отношению к запаху ацетофенона (природное ароматическое соединение, присутствующее, в том числе, в аромате черемухи), подавая в экспериментальную камеру одновременно с ацетофеноном разряды электрического тока, а затем получили потомство от скрещивания обученных самцов с необученными самками. Красота дизайна эксперимента заключалась в том, что рецепторный белок для ацетофенона и кодирующий его ген хорошо известны, так что результаты можно было регистрировать на всех уровнях — от экспрессии гена до анатомии обонятельного эпителия и изменений в поведении животных.

Тщательный анализ обнаружил, что у мышей в потомстве, во-первых, было повышено количество клеток с рецептором к данному соединению в обонятельном эпителии. Во-вторых, оказалась повышена восприимчивость животных к соответствующему запаху: зверьки демонстрировали более выраженную реакцию тревоги в ответ на сигнал опасности (громкий звук) в присутствии ацетофенона (но не пропанола, который распознается другими чувствительными клетками с другими рецепторами). Также выяснилось, что в сперматозоидах обученных мышей и их потомства был снижен уровень метилирования гена, который, собственно, и кодирует рецептор к ацетофенону. Эффект поддерживался в двух поколениях потомства, которые не проходили соответствующего обучения.

Авторы исключают вариант, что эпимутация, затронувшая именно ген рецептора к ацетофенону, в сперматозоидах опытных животных произошла случайно, поскольку идентичные сдвиги в фенотипе потомства на всех уровнях хорошо воспроизводились при многократных воспроизведениях опыта. Аналогичные результаты были получены и в том случае, если в родительском поколении обучали самок. При таком дизайне эксперимента новорожденных мышат сразу передавали необученной приемной матери, так что социальный фактор был исключен.

На сегодняшний день наиболее перспективными агентами переноса и индукции эпимутаций представляются регуляторные РНК, характеризующиеся способностью с высокой специфичностью переключать состояние хроматина и экспрессию генов на определенных участках хромосом. В 2010 году коллективом авторов был опубликован обобщающий обзор с описанием целого ряда проведенных ими экспериментов по индукции трансгенерационной эпигенетической наследственности у мышей, где убедительно доказана ключевая роль РНК в реализации этой наследственности (M. Rassoulzadegan, F. Cuzin, 2010. The making of an organ: RNA mediated developmental controls in mice).

Имеются и претенденты на роль транспортных средств для переноса между клетками регуляторных РНК: это внеклеточные везикулы — мембранные пузырьки, производимые клетками всех тканей организма и способные передавать свое содержимое другим клеткам, в том числе других тканей. (Подробно о внеклеточных везикулах, в частности об экзосомах, см. также новость Клетки организма общаются с помощью посланий, упакованных в микровезикулы, «Элементы», 28.12.2010 и статью Экзосомы — бутылочная почта организма.) Надо отметить, что наработка этих везикул является процессом активным, тканеспецифичным и зависимым от физиологического состояния клеток. В частности, их производство резко возрастает, когда клетки испытывают стрессовые воздействия, причем в этих условиях меняется также и их содержимое, включающее разнообразные белки, матричные и регуляторные РНК. В мембране таких везикул могут присутствовать указатели «адреса доставки» в форме тканеспецифичных рецепторов, обеспечивая неслучайный характер такой формы межклеточной коммуникации.

Это всё рассуждения и гипотезы, но на практике до сих пор никто еще не брался проверить, могут ли на самом деле молекулы РНК быть доставлены от соматических клеток к половым, и если да, то принимают ли экзосомы в этом участие. Исследование, проведенное итальянскими учеными, и было нацелено на восполнение этого пробела. Схема поставленного авторами эксперимента предельно проста, она показана на рис. 2.

Рис. 2. Схема эксперимента по передаче информации от соматических клеток к сперматозоидам. Пояснения даны в тексте. Рисункок из обсуждаемой статьи в PLoS One

В геном клеток человеческой меланомной линии А-375 при помощи вирусного вектора был введен ген зеленого флуоресцентного белка (GFP), который исходно не присутствует ни в геноме человека, ни в геноме мыши, то есть легко отличим от эндогенных продуктов. Успешность операции проверили рядом тестов, которые продемонстрировали, что ген действительно встроился в ДНК, что с этого гена нарабатывается матричная РНК и что на этой матричной РНК нарабатывается белок (что и заставляет клетки светиться зеленым цветом, как видно на фотографии). Также были собраны и очищены экзосомы, вырабатываемые и высвобождаемые модифицированными клетками в культуральную среду. Провели те же тесты. Оказалось, что ДНК гена GFP в экзосомах нет, а вот РНК и собственно белок GFP — присутствуют. Наконец, модифицированные человеческие клетки меланомы ввели подкожно мышам (иммунодефицитным, чтобы не было отторжения человеческих клеток). Клеточная линия была выбрана исходя из того, что, по предварительным данным, эти клетки хорошо приживались у использованной линии мышей и интенсивно производили экзосомы, что повышало шанс на получение положительного результата. В исследовании было задействовано 25 животных, из которых пятнадцати (экспериментальная группа) были привиты модифицированные клетки (с геном GFP), а еще десяти (контрольная группа) — немодифицированные.

Через 45 дней (к этому времени трансплантированные клетки успевали размножиться и новообразованная опухоль имела объем около 1 см³) проводили итоговые исследования. Прежде всего, были проведены анализы на присутствие РНК гена GFP в крови животных (использовали смешанный препарат крови 10 зверьков экспериментальной группы). Для анализов использовали методы ПЦР и гибридизации нуклеиновых кислот. Результат оказался положительным. Затем убедились, что РНК гена GFP обнаруживается в экзосомах, очищенных из крови той же группы экспериментальных животных. И, наконец, эта же РНК была обнаружена в сперматозоидах. Препараты РНК сперматозоидов также готовили из смешанного образца от 10 животных и снова получили положительный результат. РНК гена GFP успешно детектировалась и в смешанном образце сперматозоидов, полученных от еще двух зверьков экспериментальной группы. Дополнительный анализ индивидуальных образцов РНК сперматозоидов от трех оставшихся зверьков дал один отрицательный результат и два положительных. Параллельно аналогичные процедуры и анализы выполнялись для образцов крови, экзосом и сперматозоидов от животных контрольной группы. Как и следовало ожидать, ни в одном из этих образцов РНК гена GFP не обнаруживалась, хотя реакции на присутствие РНК собственных генов были положительными как в экспериментальной, так и в контрольной группе.

Авторы работы делают заключение о том, что такого непреодолимого барьера, который бы делал невозможной передачу генетической информации между соматическими и половыми клетками, не существует, а значит, теоретически, передача РНК с экзосомами вполне может работать в качестве одного из механизмов, обеспечивающих трансгенерационное эпигенетическое наследование приобретенных родителями адаптивных модификаций. Конечно, дизайн эксперимента предполагал создание достаточно неестественной ситуации: ведь и ген был чужеродный, и сами донорские клетки — тоже, но тем более ожидаемым было бы срабатывание защитного барьера, если он действительно существует. И тем более вероятно, что аналогичные процессы могут иметь место в естественной физиологии.

Насколько точно обнаруженное явление соответствует Дарвиновскому пангенезису? Идея Дарвина заключалась в том, что геммулы, перенося какие-то вещества от соматических клеток к половым, могут менять материал наследственности в направлении, соответствующем выработанной на уровне соматических тканей адаптации, и, таким образом, благоприятствуют реализации адаптивно направленной эволюции. Но эпигенетическая наследственность, как было сказано выше, неустойчива и легко обратима, в то время как, говоря об эволюции, мы имеем ввиду некие устойчивые и трудно обратимые изменения, закрепленные в генотипе. Может ли перенос РНК в составе экзосом на самом деле обеспечить направленное изменение генома?

Можно предположить существование нескольких путей такого влияния. Во-первых, регуляторные РНК вызывают локальные изменения состояния хроматина, что должно сказываться определенным образом на распределении вероятностей мутационных событий на ДНК в тех или иных областях. Во-вторых, учитывая высокую активность обратной транскриптазы в сперматозоидах и их предшественниках, есть вероятность приобретения в ходе обратной транскрипции с матричных РНК новых ретрогенов либо редактирования уже имеющихся в геноме последовательностей по механизму конверсии (изменения нуклеотидной последовательности в геноме путем «списывания» с похожей, но не идентичной последовательности на внешней матрице, в том числе на матрице РНК или ее ДНК-копии). В-третьих, в свете данных рассматриваемой статьи, где был продемонстрирован перенос при участии экзосом РНК совершенно чужеродного гена между клетками разных видов (а именно, от человеческих меланомных клеток к мышиным половым), нельзя исключить и роль указанного механизма в горизонтальном переносе генов. Здесь можно вспомнить, например, нематод, в геном которых каким-то образом оказались встроены гены бактериального происхождения, благодаря чему этим организмам и удалось приспособиться к эффективному паразитизму на растениях (см. Бактериальные гены помогают нематодам паразитировать на растениях, «Элементы», 18.10.2010).

Источник: C. Cossetti, L. Lugini, L. Astrologo, I. Saggio, S. Fais, C. Spadafora. Soma-to-germline transmission of RNA in mice xenografted with human tumour cells: possible transport by exosomes // PLoS One. 2014. V. 9(7): e101629.

См. также:
1) B. G. Dias, K. J. Ressler. Parental olfactory experience influences behavior and neural structure in subsequent generations // Nature Neuroscience. 2014. V. 17. P. 89–96. 
2) M. Rassoulzadegan, F. Cuzin. The making of an organ: RNA mediated developmental controls in mice // Organogenesis. 2010. V. 6. P. 33–36.
3) Э. Стил, Р. Линдли, Р. Бландэн. «Что, если Ламарк прав?». М: Мир. 2002.
4) А. Марков «От Ламарка к Дарвину... и обратно» // «Экология и жизнь» №1, 2008.

Татьяна Романовская