Созданы рибозимы, синтезирующие зеркальные копии самих себя

Рис. 1. Так на заре жизни могла происходить взаимная репликация левых (L) и правых (D) рибозимов. Левый рибозим (L-Ribozyme) сшивает (лигирует) правые олигонуклеотиды (D-oligonucleotide), присоединившиеся к комплементарной правой матрице (D-Template). В результате образуется двойная спираль из двух комплементарных нитей правой РНК (Duplex D-product). Затем она расплетается на две нити (Strand separation), одна из которых (D-Ribozyme) катализирует соединение левых олигонуклеотидов (L-Oligonucleotide) на левой матрице (L-Template). После разделения нитей получившегося дуплекса образуется левый рибозим. Изображение из синопсиса к обсуждаемой статье в Nature

Американские ученые еще на шаг приблизились к созданию саморазмножающихся комплексов молекул РНК, подобных тем, с которых могла начаться земная жизнь. Методом искусственной эволюции получены рибозимы, катализирующие матричный синтез молекул РНК противоположной хиральности: «правые» РНК катализируют репликацию «левых» и наоборот. Новые рибозимы умеют синтезировать в том числе и собственные зеркальные копии, которые, в свою очередь, катализируют репликацию исходных рибозимов. Исследование показало возможный путь решения двух проблем, стоящих перед теорией мира РНК: проблемы хирального ингибирования (в отличие от полученных ранее рибозимов — РНК-полимераз, работа новых рибозимов не тормозится в присутствии нуклеотидов противоположной хиральности) и проблемы зависимости от матрицы. Левые и правые нити РНК не образуют друг с другом уотсон-криковских связей, поэтому эффективность работы новых рибозимов практически не зависит от последовательности нуклеотидов в реплицируемой матрице.

В большинстве версий теории «мира РНК» предполагается, что на определенном этапе эволюции существовали рибозимы с РНК-полимеразной активностью, то есть молекулы РНК, способные катализировать репликацию (размножение) других молекул РНК, примерно так, как это делают современные белковые ферменты-полимеразы. Теоретически, репликация РНК на заре жизни могла катализироваться не напрямую рибозимами, а, скажем, короткими пептидами (синтез которых, в свою очередь, мог катализироваться рибозимами) или РНК-пептидными комплексами. Но предположение о существовании молекул РНК, умеющих размножать молекулы РНК напрямую и без посредников, кажется более простым и потому заманчивым.

У современных живых организмов рибозимов с РНК-полимеразной активностью нет. Это и неудивительно: их давно должны были вытеснить более эффективные белковые полимеразы. Поэтому ученые пытаются получить их искусственно, сочетая методы «искусственной эволюции» и «разумного дизайна» (целенаправленного проектирования).

В громадном «пространстве последовательностей» (Sequence space) всех возможных молекул РНК уже найдены рибозимы, способные катализировать матричный синтез РНК (правда, с довольно низкой эффективностью). В роли матрицы выступает одиночная нить РНК, на которой из активированных нуклеотидов последовательно синтезируется комплементарная нить. Лучшие из полученных рибозимов-полимераз способны реплицировать матрицы длиной до 206 нуклеотидов, что превышает длину самого рибозима (J. Attwater et al., 2013. In-ice evolution of RNA polymerase ribozyme activity). Удалось также продемонстрировать синтез функционального рибозима (с иной каталитической активностью и меньшего размера) при помощи рибозима-полимеразы.

Недостатком известных рибозимов-полимераз является сильная зависимость их эффективности от матрицы. В отличие от белковых полимераз, им не всё равно, какие нуклеотиды и в каком порядке стоят в копируемой матрице. Поэтому далеко не всякая матрица может быть реплицирована данным рибозимом (см.: Рибозимы могут размножать друг друга, «Элементы», 13.04.2011).

Есть и другой путь — поиск комплексов рибозимов с РНК-лигазной активностью, которые могут собирать копии друг друга из кусочков — олигонуклеотидов (см.: Т. A. Lincoln, G. F. Joyce, 2009. Self-Sustained Replication of an RNA Enzyme; Тайна происхождения жизни скоро будет разгадана?, «Элементы», 12.01.2009). В этом случае эффективность работы рибозима еще сильнее зависит от последовательности нуклеотидов в молекуле субстрата (в данном случае — в соединяемых олигонуклеотидах), потому что рибозим распознает субстрат и соединяется с ним при помощи уотсон-криковских связей, на основе принципа комплементарности.

До сих пор в подобных исследованиях и сам рибозим, катализирующий размножение РНК, и размножаемая им молекула имели одну и ту же хиральность: они состояли только из «правых» нуклеотидов (в состав которых входит «правый» энантиомер рибозы). Именно из правых нуклеотидов сделаны все молекулы РНК и ДНК в живых клетках.

Джонатан Щепански (Jonathan T. Sczepanski) и Джеральд Джойс (Gerald F. Joyce) из Научно-исследовательского института имени Эллен Скриппс предположили, что на заре жизни этой асимметрии не было, а правые и левые молекулы РНК могли кооперироваться, чтобы размножать друг друга (рис. 1). Такое предположение интересно тем, что оно помогает решить сразу несколько трудных проблем.

Во-первых, в реакциях абиогенного синтеза нуклеотидов (см.: Химики преодолели главное препятствие на пути к абиогенному синтезу РНК, «Элементы», 18.05.2009) обычно получается смесь правых и левых нуклеотидов. Чтобы предполагать изначальное господство правых энантиомеров, нужно понять, как могла установиться такая асимметрия. Некоторые подходы к решению этой проблемы уже найдены (J. E. Hein et al., 2011. A route to enantiopure RNA precursors from nearly racemic starting materials). Но теория будет более экономной, если удастся показать возможность появления саморазмножающихся молекулярных комплексов на основе рацемической смеси левых и правых энантиомеров. В этом случае дарвиновская эволюция стартует до того, как установится асимметрия, которая тогда может оказаться следствием эволюционного развития, а не его предпосылкой.

Во-вторых, такой подход может решить проблему зависимости эффективности полимераз от последовательности нуклеотидов в реплицируемой матрице — зависимости, которая до сих пор не позволяла создать по-настоящему универсальный рибозим-полимеразу. Одна из главных причин этой зависимости состоит в том, что между рибозимом и матрицей формируются уотсон-криковские связи, основанные на принципе комплементарности. Но правые и левые молекулы РНК не образуют друг с другом таких связей и не сворачиваются в двойные спирали. Если бы удалось получить, например, правый рибозим, реплицирующий левую матрицу путем полимеризации левых моно- или олигонуклеотидов, то есть шанс, что работа такого рибозима не будет сильно зависеть от последовательности нуклеотидов в матрице. Ведь рибозиму в этом случае придется и узнавать свой субстрат и работать с ним без использования принципа комплементарности. Иными словами, ему придется делать всё это, полагаясь не на свою первичную структуру, а на третичную, подобно тому, как это делают белковые ферменты, работающие с нуклеиновыми кислотами.

Авторам удалось вывести искомый рибозим — кросс-хиральную РНК-полимеразу — из случайной последовательности нуклеотидов всего за 16 поколений искусственной эволюции с элементами целенаправленного проектирования. Они начали с популяции из 10¹⁵ молекул правых РНК (D-РНК) со случайной последовательностью. К каждой молекуле ковалентными связями (через промежуточный гибкий «мостик» — длинную синтетическую молекулу) прикрепляли матрицу — молекулу левой РНК (L-РНК) с заранее приделанной затравкой — праймером (рис. 2). В раствор добавляли левый олигонуклеотид, комплементарный однонитевому участку матрицы. «Задача» молекул D-РНК состояла в том, чтобы пришить этот олигонуклеотид к праймеру, создав таким образом молекулу L-РНК, комплементарную матрице.

Рис. 2. Молекулярные конструкции, использовавшиеся в первых 10 поколениях отбора (a), последующих 6 поколениях (b) и полученный в итоге рибозим (c). На рисунке a черная линия внизу — это эволюционирующая молекула D-РНК, состоящая из двух фиксированных участков по краям и случайной последовательности из 70 нуклеотидов в середине (N₇₀). Химический «мостик» (linker) показан волнистой линией. Синим цветом изображены молекулы L-РНК: матрица с приделанным праймером и олигонуклеотид GACUGGUC с прикрепленной к нему молекулой биотина (B). Изогнутой стрелкой обозначено место, в котором D-РНК должна осуществить лигирование: сшивание олигонуклеотида с праймером. На рисунке b зеленым цветом обозначена дополнительная вставка из 30 случайных нуклеотидов (N₃₀). Рисунок из обсуждаемой статьи в Nature

К олигонуклеотиду была прикреплена молекула биотина, чтобы можно было отбирать рибозимы, успешно справившиеся с задачей, при помощи шариков, покрытых стрептавидином (подробнее об этом способе отбора эволюционирующих молекул см. в новости Искусственные полимеры могут хранить генетическую информацию, «Элементы», 23.04.2012).

Рибозимы, успешно пришившие олигонуклеотид к праймеру, отбирались и размножались при помощи обратной транскрипции и ПЦР. Начиная c 7-го поколения использовалась неточная (error-prone) ПЦР, чтобы повысить генетическое разнообразие подопытной популяции. Отбор постепенно ужесточался: в первых поколениях молекулам D-РНК давали на выполнение работы 16 часов, к 10-му поколению это время сократилось до 5 минут.

После 10 поколений получившиеся рибозимы были внимательно исследованы, определен их активный центр и «вручную» удалены лишние участки. Четыре нуклеотида в активном центре были заменены на 30-нуклеотидную вставку со случайной последовательностью, после чего искусственная эволюция продолжалась еще 6 поколений.

В итоге получилась эффективная кросс-хиральная РНК-полимераза длиной всего-навсего 83 нуклеотида (рис. 2, b). Этот рибозим ускоряет реакцию присоединения олигонуклеотида к праймеру в миллион раз по сравнению с той же реакцией, идущей в отсутствие полимеразы.

Рибозим подвергся всестороннему изучению. Оказалось, что он отлично делает свое дело — реплицирует L-матрицу путем пришивания к праймеру комплементарного матрице L-нуклеотида — и в том случае, если ни матрица, ни праймер к нему не прикреплены (в ходе искусственной эволюции, как говорилось выше, они были прикреплены к рибозиму при помощи гибкого «мостика»).

Выяснилось также, что зеркальная копия полученного D-рибозима (его L-версия) точно так же может работать с D-матрицей и D-субстратом. Если смешать вместе правые и левые рибозимы, субстраты (олигонуклеотиды) и матрицы, то D-рибозим работает только с L-субстратами, реплицируя L-матрицу, а L-рибозим — только с D-субстратами, причем всё это происходит одновременно. Рибозимы не мешают друг другу, поскольку не образуют уотсон-криковских связей ни друг с другом, ни с субстратами. Каждый рибозим узнает свой субстрат не по последовательности нуклеотидов, на основе принципа комплементарности, а как-то иначе — видимо, на основе своей третичной структуры, подобно тому, как это делают белковые ферменты, работающие с РНК и ДНК.

Дальнейшие эксперименты показали, что новый рибозим способен на большее, чем пришивание стандартного олигонуклеотида к стандартному праймеру на стандартной матрице. Он может реплицировать самые разнообразные матрицы противоположной хиральности, используя для этого разные олигонуклеотиды и даже отдельные активированные нуклеотиды (как белковые полимеразы и как полученные ранее рибозимы-полимеразы, работающие с субстратами той же хиральности, см. рис. 3). Правда, присоединять нуклеотиды G и C у него получается гораздо лучше, чем A и U. Возможно, это связано с тем, что в ходе искусственной эволюции его «учили» соединять два олигонуклеотида, один из которых кончается на C, а другой начинается на G (рис. 2). Но авторы полагают, что это дело поправимое. Ведь их рибозим еще очень «молод»: всего 16 поколений искусственной эволюции отделяют его от случайной последовательности. Скорее всего, в будущем его удастся существенно улучшить.

Рис. 3. Два примера длинных (50 и 49 нуклеотидов) правых матриц, реплицированных левым рибозимом — кросс-хиральной РНК-полимеразой — путем соединения многочисленных правых олиго- и мононуклеотидов. Места, в которых рибозим соединил (лигировал) фрагменты синтезируемой молекулы РНК, показаны точками. В качестве мононуклеотида всегда выступал гуанозин (G), потому что с другими нуклеотидами рибозим работает намного менее эффективно. Рисунок из обсуждаемой статьи в Nature

Несомненное достоинство нового рибозима в том, что он обладает высокой избирательностью по отношению к нуклеотидам разной хиральности: D-рибозим использует только L-нуклеотиды и наоборот. Если предложить D-рибозиму в качестве субстрата смесь левых и правых нуклеотидов, то он безошибочно использует для репликации L-матрицы только L-нуклеотиды (а D-матрицы и D-нуклеотиды он попросту игнорирует). Присутствие в растворе D-нуклеотидов не замедляет репликацию D-рибозимом L-матрицы.

Последний результат очень важен, поскольку он решает еще одну проблему теории мира РНК — проблему «хирального ингибирования». Исследовавшиеся до сих пор «пребиотические» механизмы репликации РНК (и медленная, с огромным трудом идущая неферментативная репликация, и более эффективная репликация при помощи рибозимов той же хиральности) просто не работают в присутствии активированных нуклеотидов противоположной хиральности. Репликация правой матрицы тормозится случайно присоединившимися левыми нуклеотидами. Поэтому эксперименты по неферментативной репликации и по выведению рибозимов-полимераз традиционно проводились в «хирально чистой» обстановке, а именно — в присутствии только правых нуклеотидов (матрицы и рибозимы тоже использовались правые). При этом вопрос о том, как на заре жизни могли возникнуть такие «хирально чистые» обстановки, заметался под ковер. Открытие Щепански и Джойса дает красивое решение этой проблемы.

В качестве завершающего эксперимента, демонстрирующего возможности новой кросс-хиральной РНК-полимеразы, авторы предложили своему D-рибозиму собрать собственную зеркальную копию (L-рибозим) из 11 подходящих кусочков — олигонуклеотидов. Эксперимент прошел удачно, а полученный таким способом L-рибозим оказался вполне функциональным (для полной уверенности его специально проверили на способность реплицировать D-РНК). Авторы скромно отмечают, что, насколько им известно, это первое сообщение о синтезе активного рибозима собственным энантиомером.

Современная жизнь основана исключительно на правых молекулах РНК и ДНК, но было ли так с самого начала? Результаты Щепански и Джойса позволяют предположить, что нет. Но если кросс-хиральные РНК-полимеразы действительно сыграли какую-то роль на ранних этапах становления жизни, то возникает естественный вопрос, как эти рибозимы появились. Очевидно, до их появления должна была существовать какая-то более примитивная система синтеза «чисто левых» и «чисто правых» молекул РНК. Она могла быть основана либо на каком-то другом полимере, у которого не было энантиомеров и который мог катализировать полимеризацию нуклеотидов одинаковой хиральности, производя как левые, так и правые молекулы РНК, либо на неферментативной репликации РНК (см. Синтез РНК в «протоклетках» все-таки возможен, «Элементы», 02.12.2013), в ходе которой каким-то образом происходил отбор «чистых» левых или правых полимеров. В дальнейшем такие молекулы РНК приобрели способность катализировать репликацию молекул противоположной хиральности, что позволило сформироваться сообществам размножающих друг друга левых и правых молекул. Причем эти молекулы не обязаны были быть зеркальными отражениями друг друга, как в описанном эксперименте: они могли быть разными.

Переход от этого исходного, симметричного содружества левых и правых РНК к нынешнему абсолютному преобладанию правых молекул мог произойти в результате какого-то важного эволюционного «изобретения», которое было сделано, по чистой случайности, именно правыми рибозимами. Таким изобретением мог быть, например, контролируемый синтез пептидов. Пептиды вскоре взяли на себя функцию репликации правых РНК. После этого левые РНК стали избыточными и исчезли: по образному выражению авторов, «левая сторона зеркала потемнела». Но всё это, конечно, пока лишь грубые наброски. Чтобы превратить их в убедительную теорию, придется сделать еще много новых открытий.

Источник: Jonathan T. Sczepanski, Gerald F. Joyce. A cross-chiral RNA polymerase ribozyme // Nature. Published online 29 October 2014.

См. также:
1) Рибозимы могут размножать друг друга, «Элементы», 13.04.2011.
2) Синтез РНК в «протоклетках» все-таки возможен, «Элементы», 02.12.2013.
3) Тайна происхождения жизни скоро будет разгадана?, «Элементы», 12.01.2009.

Александр Марков