Радиоизлучение может играть в организме роль универсального «рубильника»

Рис. 1. Схема методики. Наночастицы (Nanoparticle) связаны с антителами к гистидиновой метке (Anti-his-antibody) и потому присоединяются к TRPV1-рецептору, помеченному гистидиновой меткой. Под действием радиоволн (radio waves) наночастицы нагреваются и выделяют тепло (Heat), что приводит к открыванию рецептора и входа в клетки ионов Ca²⁺. К кальциевым ионам через цепочку белков (Calcineurin, nFAT) «привязана» экспрессия инсулина (как это сделано, подробно описано в новости Синтезом белков можно управлять с помощью света, «Элементы», 05.07.2011). Изображение из обсуждаемой статьи в Science

Мир, который несколько десятилетий назад описывали в своих произведениях фантасты, постепенно воплощается в реальность. Одна из последних разработок — работа американских ученых, опубликованная в недавнем номере Science. Это просто невероятно: исследователи научились с помощью радиоволн понижать уровень глюкозы в крови у подопытных мышей.

Нанотехнологии развиваются в бешеном темпе, позволяяя достичь результатов, немыслимых буквально десятилетие назад (см. Предложен способ лечения рака с помощью графена и лазера, «Элементы», 07.09.2010, 3D-нанозонды творят чудеса, «Элементы», 23.08.2010). Однако с сожалением надо отметить, что большое количество нанотехнологических исследований посвящено рутинным, а не революционным разработкам. В сущности, делается то, что уже было сделано прежде, с небольшими улучшениями и вариациями — как правило, наночастицы используются в качестве биосенсоров для определения тех или иных веществ либо как приспособления для высвобождения лекарств (см. drug delivery).

Но ясно, что наночастицы способны на гораздо большее. Именно этого «большего» и смогла добиться команда американских ученых под руководством Джеффри Фридмана. Исследователям удалось создать методику получения необходимых реакций клетки с помощью радиоволн. Радиоволны нагревают металлические наночастицы, связанные с особыми рецепторами на клеточной мембране, а эти рецепторы активируются при нагревании и вызывают необходимые клеточные ответы. Получается, что радиоволны — это что-то вроде рубильника, который может вызвать почти любую желаемую реакцию клетки.

Основные предпосылки для работы были таковы. Предположим, нам нужно чего-то добиться от организма — возбуждения определенных нейронов или мышц, выделения железистыми клетками какого-то вещества, и так далее. Как это сделать?

Можно подобрать химические вещества, которые воздействуют на рецепторы в клетках-мишенях или другим способом вызывают нужные нам эффекты. Но тут перед нами встает множество проблем. Во-первых, подходящего вещества может просто не оказаться. Во-вторых, даже если оно есть, оно может иметь неприятные побочные действия, например влиять не только на те клетки, которые нам нужны, но и на другие тоже. В-третьих, если мы работаем с нервной системой, то велика вероятность, что выбранное нами вещество не сможет пройти через гемато-энцефалический барьер, и от него не будет никакого толку.

Что ж, тогда можно сделать дешево и сердито: ткнуть в клетку электродом, пустить по нему ток и тогда (если, конечно, клетка выживет и будет сносно себя чувствовать) добиться определенного эффекта. Метод этот ненадежен, травматичен и имеет огромное количество ограничений и побочных эффектов.

Наконец, существует еще один, гораздо более изящный и бережный, способ — оптогенетика. Создаем генетически модифицированное существо, у которого в необходимых клетках экспрессируются особые ионные каналы, реагирующие на свет, например чэннелродопсин. Вживляем созданному животному в нужное место осветительный прибор (как правило, лазер) и светим; «поймав» свет, ионные каналы возбуждаются и вызывают необходимую реакцию клетки.

Метод, конечно, хорош, но и у него недостатков множество. Во-первых, это дорого. Во-вторых, нужно заранее выводить специальную линию животных. В-третьих, вживление лазера может быть травматичным, а иногда (если мы решим освещать средний мозг или что-нибудь столь же труднодоступное) и смертельным для подопытного организма.

Необходимость вживления лазера — это, пожалуй, самая большая проблема. Всё дело в том, что свет не проникает сквозь живые ткани, и его нужно доставлять туда искусственно. Вот если бы можно было найти какой-нибудь другой «возбудитель», для которого живая ткань не была бы препятствием...

Например, радиоизлучение. Радиоволны низкой и средней частоты прекрасно проникают сквозь ткани, поскольку поглощение их этими тканями (и влияние на эти ткани) минимально. Другие же субстраты, например металлические наночастицы, наоборот, прекрасно поглощают радиоволны и поэтому от них нагреваются (степень нагрева зависит от размера наночастицы, ее состава и напряженности поля). Поэтому если мы засунем в организм наночастицы, а затем облучим его радиоволнами, то частицы нагреются, а сам организм — нет.

Ну и что? Какая польза нам от того, что где-то внутри животного плавает крохотный горячий кусочек металла?

Польза на самом деле огромная. Дело в том, что существуют специальные клеточные рецепторы, реагирующие на тепло, — капсаициновые рецепторы, или TRPV1. При температуре выше 43°C эти рецепторы открываются и пропускают сквозь себя ионные токи — в основном, кальциевые. А ионы кальция хороши тем, что к ним можно «привязать» практически любую клеточную реакцию (то есть мы можем заставить клетку делать нужные вещи после того, как в ней повысился уровень кальциевых ионов). Поэтому если нам удастся «посадить» рецептор на нужную клетку, затем каким-то образом связать его с наночастицей, а потом нагреть ее, то у нас получится универсальная система для манипулирования практически любыми клетками.

Как же всего этого добиться? Начнем по порядку.

Итак, первое, что нужно сделать, это «посадить» TRPV1-рецепторы на необходимые клетки (то есть заставить клетки экспрессировать ген этого рецептора). Для этого существуют досконально разработанные методики, известные под названием «нок-ин» (см. gene knock-in) и обратные нокауту (см. gene knockout), при котором ген из клеток, наоборот, выбивается.

Следующий шаг — связать рецепторы (находящиеся на клетках) с наночастицами (плавающими где-то снаружи). Для этого есть элегантный и простой ход. Достаточно приделать к рецептору какую-нибудь «финтифлюшку», которая бы, с одной стороны, обладала яркой индивидуальностью (то есть была достаточно уникальна, чтобы существовали какие-то вещества, связывающиеся только с ней и ни с чем больше), а с другой — не мешала рецептору выполнять свою функцию. Наночастицу же надо покрыть этими самыми связывающимися с «финтифлюшкой» веществами. Теперь, едва встретившись, рецептор и наночастица крепко прилипнут друг к другу, и нагревая наночастицу, мы сможем на этот рецептор влиять. В данном случае в качестве «финтифлюшки» использовалась полигистидиновая метка (см. polyhistidine-tag), а в качестве вещества, с ней связывающегося, — соответственно, антитела к этой метке. В результате мы не только добиваемся соединения рецептора и наночастицы, но и избавляемся от «врожденных» TRPV1-рецепторов, то есть тех, которые сами по себе экспрессируются организмом, а потому не помечены нашей меткой, находятся на ненужных нам клетках и которые нам совершенно не нужно активировать.

И вот перед нами стабильная система: наночастицы связаны с рецепторами, сидящими на нужных клетках (и только на них). Теперь достаточно облучить организм радиоволнами, чтобы нагреть наночастицы, вызвать таким образом активацию рецепторов, вход кальциевых ионов в клетку и необходимые клеточные ответы.

Осталось рассказать о конкретных деталях, использованных в данной работе.

В качестве наночастиц использовались наночастицы оксида железа Fe₃O₄ — FeNPs, которые нагреваются при относительно низкой частоте излучения в 465 кГц (нагревания тканей организма при этой частоте практически не происходит). Размер частиц составлял 20 нм, благодаря чему они могли относительно свободно передвигаться по внеклеточному пространству. В ответ на радиооблучение клетки должны были начать вырабатывать инсулин — белковый гормон, главным действием которого является понижение уровня глюкозы в крови.

Вначале исследователи решили проверить, будет ли работать их методика не на целом организме, а хотя бы на отдельных клетках. Для этого они взяли клеточную линию HEK293, в которую, из-за некоторых ее особенностей, очень удобно встраивать новые генетические конструкции. В данном случае эти клетки несли, во-первых, TRPV1-рецепторы с полигистидиновой меткой (TRPV1‑His), а во-вторых — Ca²⁺‑зависимую систему синтеза инсулина. Иными словами, при увеличении внутриклеточного уровня ионов кальция данные клетки начинали производить инсулин.

Добавив к этой клеточной культуре наночастицы, покрытые антителами к полигистидиновой метке, исследователи облучили получившуюся смесь радиоволнами и... обнаружили сильное повышение уровня вырабатываемого клетками предшественника инсулина — проинсулина, а также уровня инсулиновой мРНК. Методика работала!

Пришло время для экспериментов на животных. Для этого исследователи использовали линию нейроэндокринных клеток PC‑12, которая способна вырабатывать значительные количества белков.

В эти клетки исследователи встроили вышеописанную систему TRPV1‑His‑Ins (то есть Ca²⁺‑зависимо вырабатывающую инсулин и содержащую TRPV1 с гистидиновой меткой), а затем имплантировали эти клетки голым мышам (см. nude mouse; у этих мышей очень слабая иммунная система, поэтому их организм почти не отторгает пересаженные клетки). Клетки прижились и начали делиться, что привело к развитию у животных опухолей.

Затем опытным мышам в опухоль инъецировали наночастицы, а контрольным — физиологический раствор. После этого животных облучили радиоволнами и проверили уровень инсулина и глюкозы у них в крови. Уровень инсулина повышался, а уровень глюкозы падал (рис. 2) — это означало, что система работает и на целом организме.

Рис. 2. Под действием радиоволн (RF) в крови подопытных мышей падает уровень глюкозы. График, маркированный черными квадратиками, — опытные мыши, которым инъецировали наночастицы. График, маркированный белыми квадратиками, — контрольные мыши, которым инъецировали физраствор. По горизонтальной оси — время в минутах. По вертикальной оси — изменение уровня глюкозы в крови по сравнению с первоначальным в миллиграммах на децилитр. Изображение из обсуждаемой статьи в Science

Результаты были блестящими, но исследователям и этого показалось мало. Их угнетало, что разработанная методика требовала либо инкубирования наночастиц с клетками (in vitro), либо инъецирования этих частиц в организм (in vivo). А что если заставить сами клетки производить наночастицы? Эта нереальная на первый взгляд задача на самом деле легко осуществима. Белковый комплекс ферритин, являющийся в клетке основным депо железа, может формировать нечто вроде естественных парамагнитных наночастиц. Кроме того, в недавнем исследовании (K. Ziv et al., 2010. Ferritin as a reporter gene for MRI: Chronic liver over expression of H-ferritin during dietary iron supplementation and aging, PDF, 3 МБ) было показано, что ферритин может без особых последствий в течение длительного времени оверэкспрессироваться в мышином организме. Если ферритин будет плавать внутри клетки, то не надо будет заботиться о том, чтобы он соединился с TRPV1-рецептором, он и так будет находиться где-то рядом. Клетка при этом, конечно, сильно нагреется, и это может оказаться серьезным подводным камнем данной методики. Однако создание практически саморегулирующейся системы, не требующей добавления никаких веществ извне, того стоит.

Рис. 3. Схема работы методики с эндогенными наночастицами. Ферритиновые частицы, нагреваясь от радиоизлучения, передают тепло на рецептор и обеспечивают таким образом приток в клетку ионов кальция. Изображение из обсуждаемой статьи в Science

Итак, исследователи заставили клетки экспрессировать:
  1) слегка модифицированный ферритин;
  2) TRPV1-рецептор и
  3) вышеописанную Ca²⁺‑зависимую систему экспрессии инсулина.

И в результате после радиооблучения уровень вырабатываемого проинсулина тоже резко повысился! Однако эффективность данной методики была где-то на треть ниже, чем предыдущей, где наночастицы плавали снаружи клетки. Зато эта методика не зависит от инъекций и является, если можно так выразиться, более самодостаточной; кроме того, генетически кодируемые наночастицы дают гораздо больше свободы: можно, например, заставить их экспрессироваться дисперсно по организму, работать в определенном типе клеток и так далее. Методика явно будет совершенствоваться и дальше — например, можно использовать разные наночастицы, которые нагреваются при разной длине волны, чтобы при разных диапазонах радиоизлучения добиваться разных эффектов.

И вот перед нами потрясающая новая методика, которая пятьдесят лет назад разве что снилась фантастам в самых смелых снах. В будущем она сулит человечеству множество благ. В воображении возникают гигантские биореакторы, в которых под действием радиоизлучения культурами клеток производятся сложнейшие вещества; медицина, не требующая ни лекарств, ни операций — ничего, кроме радиоволн; ученые-экспериментаторы, которые вместо кропотливых и дорогостоящих манипуляций всего лишь облучают подопытные организмы радиоволнами, чтобы получить необходимый результат.

Однако помимо этих идиллических картин видятся и другие. Ровные ряды биокиборгов с наночастицами в центре агрессии (в вентролатеральном отделе вентромедиального ядра, см. ventromedial nucleus, Dayu Lin et al., 2011. Functional identification of an aggression locus in the mouse hypothalamus), которые впадают в ярость по повороту рубильника. Радионаркоманы, без конца стимулирующие наночастицы в центре удовольствия. И многие другие ужасы, уже описанные в фантастических романах. Будем надеяться, нам удастся всего этого избежать.

Источник: Sarah A. Stanley, Jennifer E. Gagner, Shadi Damanpour, Mitsukuni Yoshida, Jonathan S. Dordick, Jeffrey M. Friedman. Radio-Wave Heating of Iron Oxide Nanoparticles Can Regulate Plasma Glucose in Mice // Science. V. 336. P. 604–608.

Вера Башмакова