Элементы Элементы большой науки

Поставить закладку

Напишите нам

Карта сайта

Содержание
Энциклопедия
Новости науки
LHC
Картинка дня
Библиотека
Видеотека
Книжный клуб
Задачи
Масштабы: времена
Детские вопросы
Плакаты
Научный календарь
Наука и право
ЖОБ
Наука в Рунете

Поиск

Подпишитесь на «Элементы»


ВКонтакте
в Твиттере
в Фейсбуке



Библиотека

 
Ф. Вильчек
«Красота физики». Глава из книги


Дж. Бэрроу
«История науки в знаменитых изображениях». Глава из книги


Ж. Резникова
И даман поманил за собой


В. Сурдин
Поиски новых планет


С. Горбунов
Сeratotherium simum cottoni. Последний из могикан


Д. Никифоров и др.
ЭКО: длинная история короткой встречи


А. Никонов
Небывалое бедствие в селе Кашкаранцы


Л. Сасскинд, Дж. Грабовски
«Теоретический минимум». Глава из книги


А. Сергеев, А. Благодатский
Насекомые и бионика: загадки зрительного аппарата


Л. Смолин
«Возвращение времени». Глава из книги







Главная / Новости науки версия для печати

Прокариотическая система иммунитета поможет редактировать геном


Рис. 1. Созревание crРНК в CRISPR-системе I типа

Рис. 1. Созревание crРНК в CRISPR-системе I типа. CRISPR-участок состоит из одинаковых последовательностей длиной примерно 30 нуклеотидов (повторов), разделенных разными последовательностями длиной тоже примерно 30 нуклеотидов (спейсерами). CRISPR-участки собраны в группы (кассеты); количество CRISPR в кассете и количество кассет очень разнится у разных видов бактерий и архей: у архей в одной кассете может быть аж 300–500 CRISPR. Повторы отличаются у разных видов прокариот; что касается спейсеров, то их набор вообще уникален для каждого штамма. CRISPR-кассеты соседствуют с так называемыми Cas-генами, вносящими серьезный вклад в работу CRISPR-системы (подробнее о них рассказано в подписи к рис. 2). После транскрипции CRISPR-кассеты один из Cas-белков, эндонуклеаза CasE, разрезает получившийся длинный незрелый РНК-предшественник на короткие зрелые crРНК; у получившихся crРНК фланкирующие (крайние) участки одинаковы и происходят из повторов, а середина уникальна и образована спейсером. Изображение из слайдов к лекции К. В. Северинова на Зимней школе, с изменениями

Хотя прокариоты — это одни из самых просто организованных существ на Земле (проще устроены только вирусы), их устройство поражает своим изяществом и совершенством. Например, недавно в научном мире буквально совершило переворот открытие прокариотических CRISPR-систем, которые обеспечивают приобретенный иммунитет к вирусам и плазмидам. О работе этих систем и о том, что их изучение может дать человечеству, рассказал в своей лекции на проходящей при поддержке РВК, Фонда «Династия» и РФФИ Зимней школе FutureBiotech доктор биологических наук Константин Викторович Северинов.

Загадочные участки генома

В конце 1980-х годов в ходе первых попыток секвенирования генома кишечной палочки японские исследователи обнаружили нечто удивительное — участки ДНК, содержащие множественные идентичные повторы, разделенные неидентичными, уникальными участками — спейсерами (рис. 1, 2). Подобные участки стали обнаруживать и в других прокариотах. После череды промежуточных имен их в конце концов назвали CRISPR — Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, сгруппированные регуляторные разделенные промежутками короткие палиндромные повторы. Они есть примерно у 40% бактерий и почти у всех архей.

Рис. 2. Созревание crРНК в CRISPR-системе II типа

Рис. 2. Созревание crРНК в CRISPR-системе II типа. Длинный незрелый предшественник (пре-crРНК) состоит из чередующихся повторов (показаны черным) и спейсеров (показаны зеленым). Отдельно синтезируемая некодирующая РНК (tracrРНК) комплементарна участку повтора. К повторам она и присоединяется, что приводит к разрезанию области повтора с помощью РНКазы III в присутствии белка Csn1. Это первый этап процессинга. На следующем этапе не до конца выясненным пока образом от получившихся обрезков отрезаются еще кусочки, в результате чего и получается полностью созревшая crРНК. Изображение из статьи Elitza Deltcheva et al., 2011. CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III

Функция CRISPR долгое время оставалась неясной. Однако практическая польза от CRISPR была получена и без понимания их роли: поскольку набор спейсеров уникален для каждого штамма, то с их помощью можно идентифицировать штаммы; на этом, например, основан метод сполиготипирования микобактерий туберкулеза, широко применяемый в эпидемиологии для идентификации источника возбудителя и определения очага инфекции.

Но для чего нужны эти загадочные CRISPR самим клеткам? То, что они так широко распространены в прокариотическом мире, означало, что они делают что-то очень важное, что необходимо почти всем прокариотам. Но что? Этого никто не знал.

Разгадка могла таиться в нуклеотидной последовательности CRISPR, и особенно в последовательности уникальных, не повторяющихся участков — спейсеров. Увы, до определенного времени исследования этих коротких нуклеотидных последовательностей не давали никаких результатов. Казалось, что спейсеры кодируют какую-то абракадабру, которая ничему не соответствует, ничего не определяет и ни для чего не нужна.

И вот около десяти лет назад обнаружилась одна любопытная и странная вещь. Оказалось, что последовательности спейсеров данного вида прокариот подозрительно часто совпадают с последовательностями геномов вирусов, которые поражают этот вид. Такое удивительное совпадение говорило о том, что CRISPR-система — это что-то вроде прокариотического приобретенного иммунитета, который позволяет запомнить врага и справиться с ним при повторном заражении. Приятно отметить, что важную роль в разгадке функции CRISPR сыграл наш бывший соотечественник Евгений Кунин.

CRISPR-система: приобретенный иммунитет прокариот

В настоящее время известно несколько типов CRISPR-систем. Рассмотрим вначале работу CRISPR системы, характерную для кишечной палочки Esherichia сoli.

При транскрипции CRISPR-кассеты получаются короткие некодирующие РНК — crРНК, каждая из которых состоит из спейсера, окруженного двумя участками повтора (рис. 1). Если клетку заражает вирус, последовательность ДНК которого комплементарна последовательности спейсера одной из crРНК, то клетка сможет пережить инфекцию.

Спейсер crРНК с помощью комплекса особых Cas-белков, который называется Cascade, присоединяется к комплементарному участку вирусной ДНК — протоспейсеру (для этого необходимо еще, чтобы перед протоспейсером в чужеродной ДНК находилась коротенькая нуклеотидная последовательность — PAM, protospacer associated motif). После этого к образовавшемуся комплексу подплывает еще один cas-белок — Cas3, эндонуклеаза/хеликаза, которая вносит в ДНК вируса двуцепочечный разрыв (рис. 3, B). В результате чужеродная ДНК оказывается повреждена, вирусная инфекция прекращается, а клетка «одерживает победу» и остается в живых.

Рис. 3. Механизм работы CRISPR-системы I и II типа

Рис. 3. Механизм работы CRISPR-системы I и II типа. В системе I типа (внизу) в процесс разрезания вовлечено большое количество компонентов. crРНК связывается с крупным вспомогательным белковым комплексом под названием Cascade, который образован некоторыми из cas-белков (гены белков, образующих этот комплекс, на рис. 1 показаны желтым). Обнаружив комплементарную ДНК-последовательность (протоспейсер), crРНК с помощью Cascade присоединяется к ней; это вызывает активацию фермента Cas3 (кодирующий его ген на рис. 1 показан оранжевым), который разрезает чужеродную ДНК и этим спасает клетку. В системе II типа (вверху) компонентов меньше: комплекс tracrРНК-crРНК соединяется с протоспейсерным участком чужеродной ДНК, а фермент Cas9 разрезает обе нити этой ДНК с помощью своих доменов HNH и RuvC. Отметим, что в обоих случаях для того, чтобы crРНК могла присоединиться к протоспейсеру, перед этим протоспейсером должен находиться коротенький участок под названием PAM (protospaser adjancent motif; на данном рисунке назван просто motif). Изображение из синопсиса Stan J. J. Brouns, 2012. A Swiss Army Knife of Immunity

Примерно так же устроена и работа CRISPR-системы другого типа, характерной, например, для бактерии Streptococcus thermophilus, используемой для производства многих молочнокислых продуктов, однако компонентов в ней меньше и устроена она проще. Созревание crРНК обеспечивается короткой некодирующей РНК (trans-activating crRNA или tracrРНК), комплементарной участку повтора, и широко распространенным клеточным ферментом РНКазой III (см. Ribonuclease III), а также вспомогательным белком Csn1 (рис. 2). Атака на чужеродную ДНК производится с помощью той же tracrРНК и эндонуклеазы Cas9 (рис. 3, А).

Прокариотическая CRISPR-система защиты от вирусов очень похожа на эукариотическую систему РНК-интерференции, которая также участвует в антивирусной защите и использует для этого примерно тот же прием — присоединение к нежелательной мРНК короткого комплементарного РНК-участка и последующее выключение этой ненужной мРНК тем или иным способом (например, ее можно просто разрезать на кусочки).

Часто crРНК ухитряются связаться даже с не полностью комплементарной последовательностью ДНК вируса, при условии что имеется подходящий PAM-участок и начало протоспейсера полностью комплементарно последовательности спейсера (рис. 4). Таким образом, один спейсер может одновременно обеспечивать защиту против нескольких сходных вирусов. Это удобно и позволяет сэкономить место в маленьком прокариотическом геноме.

Рис. 4. Схема связывания crРНК с чужеродной ДНК

Рис. 4. Схема связывания crРНК с чужеродной ДНК. Для этого связывания достаточно, чтобы комплементарным был только начальный участок протоспейсера (он называется seed) и чтобы перед протоспейсером находился «правильный» PAM. Изображение из статьи Semenova et al., 2011. Interference by clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) RNA is governed by a seed sequence

Однако что же делать, если клетка никогда прежде не встречалась с данным вирусом и не имеет crРНК с узнающим его спейсером? Неужели она обречена? Неужели вирус в этом случае одержит победу?

Не совсем так. Конечно, большая часть «наивных» бактерий будет уничтожена вирусом. Однако некоторые клетки ухитрятся с ним справиться — и вот каким образом (рис. 5): зараженные вирусом бактериальные клетки начинают лихорадочно вырезать все попавшиеся под руку (точнее — под фермент) участки ДНК и вставлять их в CRISPR-кассету в  качестве спейсеров (важную роль в этом процессе играют еще два Cas-белка — Cas1 и Cas2).

Рис. 5. Итоговая схема работы CRISPR-системы на примере инфекции бактерии E. coli фагом М13

Рис. 5. Итоговая схема работы CRISPR-системы на примере инфекции бактерии E. coli фагом М13.
1. Всё начинается с того, что фаг нападает на неопытную, не встречавшуюся прежде с данным возбудителем бактерию и впрыскивает в нее свою ДНК. (На рисунке показан только один нападающий фаг и только одно колечко его ДНК, оказавшееся в клетке, однако на самом деле нападающих фагов и впрыснутых ими ДНК гораздо больше.) В ответ бактерия с помощью Cas1/Cas2-белков начинает лихорадочно вырезать все попавшиеся участки ДНК — как фаговые, так и свои собственные, хозяйские — и вставлять их в качестве спейсеров в CRISPR. Если бактерии повезло и она вырезала правильный кусочек из фаговой ДНК, то...
2. Инфекция вызовет реакцию соответствующей crРНК, Cascade-комплекса и Cas3 (подробно показанную на рис. 2 и 3), в результате чего фаговая ДНК будет уничтожена. Однако фаги тоже не лыком шиты, они тоже хотят выиграть эту войну. Стоит фагу мутировать (мутация показана красной точкой), как crРНК перестанет их распознавать, и они невидимыми проникнут в клетку и начнут делать свои черные дела. Казалось бы, клетка обречена, но...
3. Даже недостаточно комплементарный кусочек фаговой ДНК активирует CRISPR-систему, причем вырезание ДНК-фрагментов будет производиться уже именно из фаговой ДНК. Судя по всему, обеспечивается это тем, что Cas1/Cas2-комплекс даже при некрепком, недостаточно комплементарном присоединении crРНК к ДНК фага начинает скользить по этой враждебной ДНК, вырезая из нее один кусочек за другим, пока не попадется участок, подходящий на роль «правильного» спейсера. Этот спейсер и спасет клетку от заражения.
Изображение из статьи Kirill A. Datsenko et al., 2012. Molecular memory of prior infections activates the CRISPR/Cas adaptive bacterial immunity system

Большая часть вставленных участков окажется бесполезной или даже вредной (например, вставка в качестве «портрета врага» участка бактериальной ДНК приведет к гибели клетки за счет раскуса собственной ДНК); однако некоторые «счастливчики» случайно вставляют в качестве CRISPR-спейсера фрагмент вирусной ДНК, что дает возможность синтезировать защитную crРНК и победить вирус. Этот новый спейсер они передадут всем своим потомкам, и поэтому от данного вируса их потомки будут защищены. Вообще, набор спейсеров в данной клетке — это, в каком-то смысле, ее история, память о прежних, выигранных, боях с вирусами.

Но это еще не всё. Оказывается, вставка спейсеров происходит по принципу положительной обратной связи, то есть вставка одного спейсера резко стимулирует вставку последующих спейсеров из ДНК донора. Так, эксперименты, проведенные в лаборатории К. В. Северинова, показали, что если у данной бактерии есть спейсер к данному вирусу, повторное заражение этим вирусом вызывает направленную вставку дополнительных спейсеров из ДНК вируса. Иными словами, если бактерия уже атаковалась раньше вирусами, то следующие атаки она перенесет легче, потому что у нее будет способность идентифицировать чужеродную ДНК и вставлять новые спейсеры. Чем-то похоже на вакцинацию, правда?

Практическое применение

Какую же практическую пользу можно извлечь из знаний о работе CRISPR-системы? Огромную, и во множестве областей.

Начнем с того, что прокариотические клетки активно используются людьми для самых разных вещей — возьмем хотя бы всем известные кисломолочные бактерии. Понятно, что одна из самых ужасных вещей, которая может случиться при производстве кисломолочных продуктов, — это атака бактериофагов, уничтожающих бактериальную культуру. Однако если мы знаем, как защитить бактерии от этой атаки, то проблем с производством кисломолочных продуктов не будет.

В то же время, другие бактерии, наоборот, могут нанести человеку, животным или растениям серьезный вред. Однако если мы знаем, как они защищаются от атак бактериофагов, то можем помешать им это делать — и так спастись от бактериальной инфекции.

Наконец, есть еще третье, на редкость перспективное, применение CRISPR-системы. С ее помощью можно с невиданной доселе аккуратностью редактировать геномы высших организмов, включая человека. Об этом недавно вышли две статьи в Science (Le Cong et al., 2013. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems; Prashant Mali et al., 2013. RNA-Guided Human Genome Engineering via Cas9), и на этом я остановлюсь поподробней.

Самые точные ножницы для генома

Для того чтобы «отредактировать» какое-то место в ДНК, например исправить мутацию, приводящую к генетическому заболеванию, надо сначала это место разрезать. При этом разрезающий фермент — эндонуклеаза — должен обладать высочайшей специфичностью, то есть резать ДНК в нужном месте и только в нем (потому что разрезание ДНК в ненужном месте может привести к совершенно ненужным последствиям). А значит, участок ДНК, по которому распознается это нужное место, должен быть как можно длиннее — ведь чем он длинней, тем меньше вероятность, что такой же участок встретится где-то еще на просторах генома и что там тоже пройдутся «ножницы» эндонуклеазы.

И вот так как защитный комплекс CRISPR-систем связывается с относительно длинными (не меньше 20 нуклеотидов) участками ДНК, соответствующими спейсерам, то возникает возможность достичь высокой специфичности редактирования.

За основу своей разработки обе группы авторов опубликованных в Science статей взяли просто устроенную систему из Streptococcus thermophilus, состоящую всего из четырех обязательных элементов — tracrРНК, crРНК, РНКазы III и Cas9 (рис. 3, А). Чем меньше компонентов, тем проще работать с системой и тем выше шанс, что система заработает в нестандартных для себя условиях работы в эукариотической клетке. Исследователям удалось еще более упростить систему. Во-первых, они создали «химерную» tracr-crРНК, которая работала ничуть не хуже, чем tracrРНК и crРНК, синтезируемые по отдельности (рис. 6). Во-вторых, они обнаружили, что бактериальная РНКаза III для работы системы не обязательна, поскольку ее функцию могут выполняют «местные» РНКазы, синтезируемые в эукариотической клетке.

Рис. 6. «Химерная» РНК имеет все ключевые фрагменты crРНК и tracrРНК, необходимые для правильного функционирования в клетке

Рис. 6. «Химерная» РНК имеет все ключевые фрагменты crРНК и tracrРНК, необходимые для правильного функционирования в клетке: направляющую последовательность (самый значимый участок спейсера, связывающийся с ДНК) и участок повтора, связанный с кусочком tracrРНК. Такая «химера» гораздо проще по структуре, чем две отдельные молекулы crРНК и tracrРНК, а работает примерно с той же эффективностью. Изображение из статьи Le Cong et al., 2013. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Сходную структуру получили и исследователи из второй группы (Prashant Mali et al., 2013. RNA-Guided Human Genome Engineering via Cas9)

Таким образом, для того чтобы разрезать в клетке ДНК в нужном месте, нужно было сделать совсем немного:

1) Поставить последовательность, комплементарную этому «нужному месту», в качестве спейсера в CRISPR-кассету и получить химерную tracr-crРНК.

2) Запустить экспрессию этой CRISPR-кассеты и белка Cas9 в соответствующей клетке, снабдив их сигналом ядерной локализации (NLS), чтобы они не «слонялись без толку» по цитоплазме, а плыли прямо в ядро, где, собственно, и находится разрезаемая ДНК.

Получившаяся система в работе на клеточных культурах показала отличные результаты: с ее помощью можно как удалять из ДНК какие-то участки, так и вставлять туда новые области. CRISPR-система показала лучшую эффективность, чем предыдущие «фавориты» в этой области — цинковопальцевые нуклеазы (см. Zinc finger nuclease) и TALEN. Нельзя, конечно, говорить о том, что CRISPR-система позволит делать с геномом всё, что только захочется исследователю, но, пожалуй, из всех существующих методик она наиболее близка к этому.

Источники:
1) Лекция К. В. Северинова на Зимней школе FutureBiotech.
2) Le Cong, F. Ann Ran, David Cox et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems // Science. V. 339. P. 819–823.
3) Prashant Mali, Luhan Yang, Kevin M. Esvelt. RNA-Guided Human Genome Engineering via Cas9 // Science. V. 339. P. 823–826.
4) John van der Oost. New Tool for Genome Surgery // Science. V. 339. P. 768–770 (синопсис к двум вышеуказанным статьям).
5) Kirill A. Datsenko, Ksenia Pougach, Anton Tikhonov et al. Molecular memory of prior infections activates the CRISPR/Cas adaptive bacterial immunity system // Nature Communications. V. 3. Article number: 945. Published 10 July 2012.
6) Ksenia Pougach, Ekaterina Semenova, Ekaterina Bogdanova et al. Transcription, Processing, and Function of CRISPR Cassettes in Escherichia coli // Mol Microbiol. V. 77. P. 1367–1379.

Вера Башмакова


Комментарии (30)



Последние новости: ГенетикаМикробиологияВера Башмакова

18.05
Обнаружены одноклеточные организмы с ядром, но без митохондрий
16.05
Уровень полученного образования отчасти зависит от генов
13.05
Удалось проследить зарождение и развитие меланомы от первой раковой клетки
10.05
ГМО будут совершенствоваться при помощи искусственной эволюции
25.04
Расшифрованы генетические основы быстрых эволюционных изменений размера клюва у дарвиновых вьюрков
20.04
Расшифровка древней ДНК рассказала о происхождении южноамериканских индейцев
18.04
Ученые выяснили, почему бактериофагам трудно бороться с иммунной системой бактерий
28.03
Изготовлена бактерия с синтетическим минимальным геномом
15.03
Регуляторные элементы вирусного происхождения помогают работе нашего иммунитета
11.03
Возникновение пятилучевого тела иглокожих не было связано с перестановкой Hox-генов


Новости науки по темам: антропология, археология, астрономическая научная картинка дня, астрономия, биология, биотехнологии, генетика, геология, затмения, информационные технологии, космос, лингвистика, математика, медицина, нанотехнологии, наука в России, наука и общество, Нобелевские премии, палеонтология, Первое апреля, психология, технологии, физика, химия, эволюция, экология, энергетика, этология

Новости науки по авторам: Валентин Анаников, Дарья Баранова, Вера Башмакова, Александр Бердичевский, Максим Борисов, Варвара Веденина, Александр Венедюхин, Михаил Волович, Михаил Гарбузов, Алексей Гиляров, Дмитрий Гиляров, Сергей Глаголев, Евгений Гордеев, Николай Горностаев, Владимир Гриньков, Дмитрий Дагаев, Юрий Ерин, Анастасия Еськова, Дмитрий Жарков, Андрей Журавлёв, Дмитрий Замолодчиков, Игорь Иванов, Вячеслав Калинин, Павел Квартальнов, Мария Кирсанова, Дмитрий Кирюхин, Александр Козловский, Юлия Кондратенко, Артем Коржиманов, Ольга Кочина, Виталий Кушниров, Иван Лаврёнов, Алексей Левин, Андрей Логинов, Сергей Лысенков, Лейла Мамирова, Александр Марков, Мария Медникова, Вадим Мокиевский, Григорий Молев, Тарас Молотилин, Марат Мусин, Максим Нагорных, Елена Наймарк, Алексей Опаев, Петр Петров, Александр Пиперски, Константин Попадьин, Сергей Попов, Роман Ракитов, Татьяна Романовская, Александр Самардак, Александр Сергеев, Андрей Сидоренко, Виктория Скобеева, Даниил Смирнов, Дарья Спасская, Любовь Стрельникова, Алексей Тимошенко, Александр Токарев, Мария Шнырёва, Сергей Ястребов, Светлана Ястребова

Новости науки по месяцам: 2016 V, IV, III, II, I  2015 XII, XI, X, IX, VIII, VII, VI, V, IV, III, II, I  2014 XII, XI, X, IX, VIII, VII, VI, V, IV, III, II, I  2013 XII, XI, X, IX, VIII, VII, VI, V, IV, III, II, I  2012 XII, XI, X, IX, VIII, VII, VI, V, IV, III, II, I  2011 XII, XI, X, IX, VIII, VII, VI, V, IV, III, II, I  2010 XII, XI, X, IX, VIII, VII, VI, V, IV, III, II, I  2009 XII, XI, X, IX, VIII, VII, VI, V, IV, III, II, I  2008 XII, XI, X, IX, VIII, VII, VI, V, IV, III, II, I  2007 XII, XI, X, IX, VIII, VII, VI, V, IV, III, II, I  2006 XII, XI, X, IX, VIII, VII, VI, V, IV, III, II, I  2005 XII, XI, X, IX, VIII, VII, VI, V, IV, III, II, I 

Новости науки почтой (рассылка на Subscribe.ru):

 


Где еще почитать научные новости: «Биомолекула», «Вокруг света», Газета.ру. Наука, «Наука и жизнь», Наука и технологии РФ, «Научная Россия», «Популярная механика», РИА Наука, «Чердак», N+1, Naked Science

 


при поддержке фонда Дмитрия Зимина - Династия