Для ядерного импорта мембранных белков нужна линкерная последовательность

Рис. 1. Вот как проходит транспорт мембранных белков в ядро. Наружная ядерная мембрана (outer nuclear membrane, ONM) переходит в мембранную систему эндоплазматической сети (endoplasmic reticulum, ER), где и происходит синтез белков на рибосомах (ribosome). Показан также просвет цистерны эндоплазматической сети (ER lumen), в который «выглядывает» люминальный домен изучаемого белка Heh2. Мембранный белок (в данном случае Heh2), предназначенный к импорту в ядро, помечен сигналом ядерной локализации (NLS), который находится на его гидрофильном участке и распознается кариоферинами α и β1, которые образуют с субстратом тройной комплекс (kariopherin α/β1 complex). Затем вместе с кариоферином β1 субстрат отправляется к комплексу ядерной поры (nuclear pore complex). Там образующие пору белки нуклеопорины своими отростками с большим количеством FG-повторов (FG-Nups) образуют что-то вроде динамичной сети (core scaffold). Кариоферин, связанный с грузом, на короткое время цепляется то за один, то за другой отросток и таким образом скользит сквозь мембрану и протаскивает вместе с собой гидрофильную часть молекулы белка. Гидрофильная же часть белка, в свою очередь, тянет за собой гидрофобные трансмембранные домены за растягивающуюся линкерную последовательность, как за веревочку. Гидрофобные домены скользят по мембране, пока не достигнут внутренней ядерной мембраны (inner nuclear membrane, INM). В результате белок мигрирует из цитоплазмы (Cytoplasm) в ядро (Nucleus), сохранив свою целостность и структуру. Изображение из статьи Richard W. Kriwacki, Mi-Kyung Yoon. Fishing in the Nuclear Pore // Science. 2011. V. 333. P. 44–45

Транспорт веществ через ядерную пору — тема сама по себе захватывающая и загадочная (см. Уточнен механизм ядерного транспорта, «Элементы», 25.09.2010). Но внутри этой темы есть одна еще более запутанная и таинственная. Речь идет о транспорте в ядро мембранных белков. Чтобы молекула прошла через ядерную пору, она должна быть помечена специальной аминокислотной последовательностью, которая называется «сигнал ядерной локализации» (nuclear localization signal или просто NLS). Белки семейства кариоферинов (см. Karyopherin; к ним, например, относятся импортины) распознают эту последовательность, подхватывают помеченный ею субстрат и переносят его в ядро.

Всё это прекрасно работает, если белок гидрофильный, то есть растворимый в воде. Но если белок мембранный, то у него есть и гидрофобные (водонерастворимые) домены, которые погружены в липидную мембрану. Такие домены не могут пройти через гидрофильную ядерную пору, и белкам приходится как-то исхитряться, чтобы проникнуть в ядро целиком, сохранив свою структуру. Группа исследователей из Голландии и Америки смогла показать, что одна из главных хитростей тут — наличие у внутриядерных мембранных белков длинного неорганизованного участка (он называется «линкером»), который соединяет между собой гидрофильную и гидрофобную части молекулы. Благодаря полному отсутствию третичной и даже вторичной структуры этот линкер может довольно сильно растягиваться и сжиматься. И получается, что, когда кариоферин перетаскивает сквозь пору гидрофильную часть белковой молекулы, эта гидрофильная часть тянет за собой скользящие по мембране гидрофобные трансмембранные домены на линкерной последовательности, как на веревочке.

Свои эксперименты ученые проводили с Heh2 — мембранным белком дрожжей, который локализуется на внутренней поверхности ядерной мембраны. К Heh2 ученые «пришили» GFP — зеленый флюоресцентный протеин — чтобы можно было увидеть, в каких участках он локализуется. В результате белок состоял из:

• GFP;
• LEM-домена, характерного для многих внутриядерных белков;
• сигнала ядерной локализации (NLS); в данном случае эта последовательность не одинарная, а двойная, и поэтому обозначена как h2NLS;
• длинного и практически не имеющего вторичной структуры линкерного региона (L);
• двух гидрофобных трансмембранных доменов (TM), которые окружают
• люминальный домен (LD), «выглядывающий» во внутренний просвет мембранной цистерны;
• и наконец, домена, сходного по структуре с соответствующим участком человеческого белка MAN1 (см. LEM domain-containing protein 3). MAN1, как и Heh2, локализуется на внутренней поверхности ядерной мембраны.

Heh2 без проблем попадает в ядро. Но какие из его многочисленных доменов для этого необходимы, а какие используются для чего-то другого, а не для ядерного транспорта? Чтобы разобраться в этом, исследователи попробовали убрать несколько доменов у Heh2 и посмотреть, какие из полученных белков попадут в ядро, а какие не смогут этого сделать.

Рис. 2. Белок Heh2 с «пришитым» к его N-концу светящимся белком GFP и полученные на его основе белки h2NLS-L-TM и L-TM. Названия доменов объясняются в тексте. Цифрами показаны номера аминокислотных остатков. N и С — N- и С-концы белковой цепочки. Изображение из обсуждаемой статьи в Science

И выяснилось, что «огрызок» Heh2, содержащий только сигнал ядерной локализации, линкерный регион и трансмембранный домен (h2NLS-L-TM), способен без проблем проходить в ядро. Однако между полноценным белком и его «огрызком» есть одно важное отличие. Если заблокировать ядерный импорт, то h2NLS-L-TM через некоторое время «переплывет» обратно в цитоплазму, а Heh2 по-прежнему останется в ядре. Это может говорить о том, что Heh2 удерживается в ядре, связываясь с какими-то внутриядерными факторами, и поэтому не возвращается назад в цитоплазму. И связывание это, судя по всему, обеспечивается именно теми доменами, которыми Heh2 отличается от h2NLS-L-TM.

Если же отрезать от h2NLS-L-TM еще и сигнал ядерной локализации, то получившийся белок (L-TM) уже не сможет оказаться в ядре. Результат, в общем, закономерный, поскольку раз молекула не помечена NLS, то она не будет распознаваться кариоферинами, а значит, путь в ядро для нее заказан. Вообще, судя по всему, тип NLS влияет на то, с какой вероятностью белок окажется в ядре. Например, если у h2NLS-L-TM заменить «оттюнингованную» двойную h2NLS на одинарную, он станет импортироваться в ядро гораздо хуже.

Итак, «наименьший импортируемый» белок h2NLS-L-TM состоит всего лишь из трех частей — сигнала ядерной локализации, линкерного домена и гидрофобного трансмембранного участка. Исследователи решили изучить свойства линкерного региона, чтобы узнать, не он ли создает возможности для ядерного импорта трансмембранных белков.

Главным же свойством этого участка было полное отсутствие каких-либо свойств. Линкерный регион совершенно «рыхлый» и не имеет ни третичной, ни даже вторичной структуры. Может быть, именно благодаря этой «неорганизованности» линкерного домена содержащие его мембранные белки и способны попадать в ядро? Чтобы проверить это, исследователи создали два «фальшивых» линкера, у которых аминокислотная последовательность была сгенерирована случайным образом. Тем не менее они походили на настоящий линкер тремя своими свойствами: были примерно той же длины, так же неорганизованны и имели примерно то же распределение аминокислот. И выяснилось, что с фальшивым линкером белок проходит в ядро ничуть не хуже, чем с настоящим.

Однако если укоротить наш линкерный участок, то транспорт белка в ядро существенно нарушится. Это наводило на мысль о том, что главное в линкерном регионе — это не конкретная аминокислотная последовательность, а отсутствие структуры и относительно большая длина. А поскольку линкер соединяет гидрофильную и гидрофобную части молекулы, это может говорить о том, что он служит чем-то вроде поводка, с помощью которого гидрофильные домены тянут за собой гидрофобные, когда проходят через ядерную пору. Поскольку линкер практически бесструктурный, он может легко растягиваться, и белок не будет поврежден, даже если его домены будут находиться далеко друг от друга.

Рис. 3. Белки с фальшивыми (LR1 и LR2) и настоящим (L) линкерами аккумулируются в ядерной мембране одинаково хорошо (левая колонка; видно, что у клеток светится только ядро, а не цитоплазма — значит, изучаемые белки хорошо аккумулируются в ядре). Если заблокировать ядерный транспорт, «выключив» работу кариоферинов с помощью рапамицина (средняя колонка, +Rap; вообще рапамицин сам по себе не может нарушить ядерный транспорт, такая чувствительность к этому антибиотику была специально выведена в особой линии клеток), то белки будут аккумулироваться не только в ядерной мембране, но и в находящемся в цитоплазме эндоплазматическом ретикулуме (видно, что у этих клеток светится не только ядро, но и цитоплазма, значит, изучаемые белки находятся и там, и там). Тот же эффект получается, если укоротить линкерную последовательность (правая колонка). Цифры обозначают количество аминокислотных остатков в линкерном участке. Всё это говорит о том, что для линкера важна не столько конкретная аминокислотная последовательность, сколько правильная структура (вернее, отсутствие таковой) и относительно большая длина. Изображение из обсуждаемой статьи в Science

Убедившись в важности линкерного участка, исследователи попробовали изучить проблему с другой стороны, а именно — понять, какие из нуклеопоринов, белков, образующих ядерную пору, особенно важны для транспорта мембранных протеинов.

Дело в том, что те нуклеопорины, которые выстилают изнутри ядерную пору, имеют одну сходную черту. В их структуре встречаются так называемые «FG-повторы» — несколько раз повторенные FG-, FXFG- или GLFG-последовательности, где F — фенилаланин, G — глицин, L — лейцин, X — любая аминокислота. Сеть FG-нуклеопоринов формирует внутри поры динамичную гелеподобную структуру, благодаря которой пора становится полупроницаемой. Считается, что кариоферины, когда переносят свой груз в ядро, слабо, мимолетно связываются то с одним, то с другим торчащим FG-«хвостом», и так проскальзывают сквозь ядерную пору.

Ученые попробовали убрать из ядерной поры некоторые из нуклеопориновых FG-повторов и посмотреть, как это скажется на транспорте мембранных белков. И выяснилось, что для мембранных белков особенно критичны GLFG повторы трех нуклеопоринов — Nups 100, 145 и 57. В то же время другие, немембранные, полностью гидрофильные белки не столь разборчивы, и приблизительно одинаково реагируют на отсутствие всех видов нуклеопоринов.

Подытоживая, можно сказать, что полученные исследователями результаты рисуют перед глазами впечатляющую картину ядерного импорта мембранных белков. Хотя эта картина еще нуждается в уточнениях, но скорее всего, она верна. По крайней мере, для многих мембранных внутриядерных белков показано наличие линкерной последовательности, соединяющей NLS с трансмембранными доменами — а это значит, что и они, скорее всего, импортируются в ядро так же, как и Heh2.

Источник: Anne C. Meinema, Justyna K. Laba, Rizqiya A. Hapsari, Renee Otten, Frans A. A. Mulder, Annemarie Kralt, Geert van den Bogaart, C. Patrick Lusk, Bert Poolman, Liesbeth M. Veenhoff. Long Unfolded Linkers Facilitate Membrane Protein Import Through the Nuclear Pore Complex // Science. 2011. V. 333. P. 90–93.

Вера Башмакова