В ходе адаптации к теплу или холоду ферменты находят одни и те же решения типовых эволюционных задач

Рис. 1. Трехмерные структуры двух версий фермента KSI (кетостероид-изомеразы). Версия, приспособленная к умеренным температурам (mesoKSI), показана светло-бежевым цветом, теплоустойчивая (thermoKSI) — красным. Структуры почти одинаковы несмотря на сильно различающиеся аминокислотные последовательности. Внизу — строение активного центра фермента. DNP — молекула субстрата, с которым аминокислотные остатки под номерами 16 и 103 должны образовать водородные связи (показаны пунктиром). У аспарагиновой кислоты (D103) это получается лучше, чем у серина (S103). Этим объясняется повышенная каталитическая активность mesoKSI по сравнению с thermoKSI. Зато от остатка аспарагиновой кислоты слишком легко отделяется протон, что снижает стабильность mesoKSI. Рисунок из обсуждаемой статьи в Science

Американские химики и биологи провели беспрецедентное по масштабу исследование закономерностей эволюции белков на примере адаптации ферментов к высоким и низким температурам. Адаптация к холоду, как правило, требует повышения каталитической активности фермента, а при высокой температуре на первый план выходит проблема стабильности его трехмерной структуры. Как выяснилось, баланс между активностью и стабильностью может определяться одним-единственным аминокислотным остатком в активном центре фермента. Например, если у фермента кетостероид-изомеразы в ключевой позиции №103 стоит аспарагиновая кислота (D103), фермент высокоактивен, но не очень стабилен, а если там находится серин (S103), то все наоборот. Самое интересное, что эти эффекты мало зависят от того, какие аминокислоты стоят во всех остальных позициях (это называют «слабым эпистазом»). В результате получается стандартный и легко проходимый эволюционный путь, доступный организмам с самыми разными версиями кетостероид-изомеразы. И действительно, в ходе адаптации к холоду в разных эволюционных ветвях бактерий много раз независимо закреплялся вариант D103, а в ходе адаптации к теплу — S103. Анализ 2194 типов ферментов (белковых семейств) у 5852 видов бактерий с известными геномами и температурными оптимумами показал, что эти особенности температурной адаптации — важность единичных замен, слабый эпистаз и вездесущие параллелизмы — характерны для многих ферментов.

Земная жизнь в ходе эволюции освоила широкий диапазон температурных условий. Одни организмы сохраняют активность при охлаждении до −15°C, другие выдерживают нагревание до +121°C. Важнейшую роль в температурной адаптации играет эволюционная «настройка» ферментов. Разные температурные условия предъявляют к ним очень разные требования. Высокие температуры грозят денатурацией, а значит, должны способствовать отбору на стабильность пространственной структуры ферментов. При низких температурах химические реакции, необходимые для жизни, замедляются. Поэтому адаптация к холоду, по идее, должна сопровождаться отбором на повышенную каталитическую активность ферментов. Действительно, при умеренных температурах порядка 20–40°C ферменты холодолюбивых микробов часто оказываются более активными, чем соответствующие (ортологичные) ферменты теплолюбивых микроорганизмов. Известно также, что температура, при которой ферменты данного микроба наиболее активны, довольно строго коррелирует с температурой, при которой микроб быстрее всего размножается.

Адаптация к различным температурным условиям — процесс, можно сказать, вездесущий, ведь всем живым существам приходится так или иначе приспосабливаться к определенному диапазону температур. Поэтому на примере температурной адаптации удобно изучать общие закономерности эволюции ферментов. Именно это и попытались сделать биологи и химики из Стэнфордского университета и Калифорнийского университета в Сан-Франциско, чья впечатляющая как по объему, так и по содержанию статья появилась 5 марта на сайте журнала Science. Ученые сосредоточились на ферментах бактерий, поскольку именно по бактериям накопилось больше всего необходимых для такого исследования данных: геномных, биохимических и экологических.

Для начала авторы досконально разобрались в механизмах температурной адаптации одного хорошо изученного фермента — кетостероид-изомеразы (ketosteroid isomerase, KSI). Затем они показали, что полученные выводы отчасти приложимы к тысячам других ферментов.

Фермент KSI катализирует изомеризацию двойных связей в молекулах стероидов. Это позволяет многим бактериям использовать стероиды в пищу. Ключевую роль в работе KSI играет так называемая оксианионная дырка (Oxyanion hole), расположенная в активном центре фермента и включающая два аминокислотных остатка (рис. 2, вверху). Обычно это остатки аспарагиновой кислоты в позиции 103 (обозначается как Asp103 или D103) и тирозина в позиции 16 (Tyr16 или Y16). Их задача — образовать водородные связи с одним из атомов кислорода в молекуле субстрата (то есть стероида, который нужно подвергнуть изомеризации).

Ученые сравнили хорошо изученную мезофильную (адаптированную к умеренным температурам порядка 30°C) версию KSI бактерии Pseudomonas putida (mesoKSI) с термофильным вариантом того же фермента (thermoKSI) из бактерии Mycobacterium hassiacum, которая хорошо растет при 65°C. Как и следовало ожидать, thermoKSI оказался более стабильным (устойчивым к нагреванию), а mesoKSI — более активным при умеренных температурах.

Аминокислотные последовательности mesoKSI и thermoKSI совпадают лишь на 33% (рис. 2, внизу), то есть это эволюционно довольно далекие друг от друга белки. Однако их трехмерные структуры, изученные авторами с большой тщательностью (в том числе при помощи рентгеноструктурного анализа), оказались почти одинаковыми (рис. 1, вверху). Это говорит о том, что большинство закрепившихся в ходе эволюции аминокислотных различий, скорее всего, не сильно повлияли на рабочие качества фермента.

Рис. 2. Вверху: схема реакции, катализируемой ферментом KSI. Суть в том, что нужно слегка перекроить молекулу субстрата — стероида (конструкция из трех шестиугольников и пятиугольника). Для этого аминокислотные остатки Tyr16 и Asp103, входящие в состав активного центра фермента, должны образовать водородные связи (показаны пунктиром) с одним из атомов кислорода молекулы субстрата. Внизу: сравнение аминокислотных последовательностей мезофильной (meso) и термофильной (thermo) версий KSI. Ключевое различие — в позиции 103, где у mesoKSI стоит аспарагиновая кислота (D), а у thermoKSI — серин (S). Рисунок из обсуждаемой статьи в Science

Ключевое различие обнаружилось в строении активного центра (рис. 1, внизу). В позиции 103 у thermoKSI вместо аспарагиновой кислоты стоит серин (замена D103S). Изучение множества мутантных ферментов, в которых исследователи заменяли аминокислоты по одной или сразу по несколько, показало, что именно замена D103S вносит основной вклад как в повышенную стабильность, так и в пониженную активность thermoKSI по сравнению с mesoKSI. Небольшое влияние оказывают еще три аминокислоты, тоже находящиеся в активном центре и различающиеся у thermoKSI и mesoKSI (позиции 86, 88 и 101), но их роль второстепенна. Весь остальной аминокислотный «контекст», столь сильно различающийся у двух версий фермента (напомним, что у них совпадает лишь 33% аминокислот), практически не сказывается на том, как аминокислота в позиции 103 влияет на стабильность и активность. Поэтому если в белке mesoKSI просто заменить аспарагиновую кислоту на серин в позиции 103, ничего больше не меняя, то сразу получится фермент, похожий по своим свойствам на thermoKSI. И наоборот, если у thermoKSI провести обратную замену (S103D), то сразу получится фермент, похожий на mesoKSI по стабильности и активности. Если вдобавок к этой «главной» позиции поменять аминокислоты также и в трех «дополнительных» (86, 88, 101), сходство получится практически полным.

Это значит, что эпистаз (то есть влияние одних замен на эффекты других) не играет большой роли в температурной адаптации фермента KSI. Вопрос о роли эпистаза важен для понимания общих принципов эволюции белков, о чем «Элементы» неоднократно рассказывали (см. ссылки в конце новости). Сильный эпистаз означает, что эволюционные изменения, возможные в одном геномном контексте, будут нереализуемы в других. Слабый эпистаз соответствует более свободному перемещению белка в пространстве последовательностей (см.: Эволюция белков сдерживается низкой проходимостью ландшафта приспособленности, «Элементы», 09.02.2015). Результаты, изложенные в обсуждаемой статье, можно интерпретировать как аргумент в пользу не очень большой роли эпистаза — если не в эволюции белков в целом, то, по крайней мере, в температурной адаптации ферментов.

Исследование показало, что между версиями фермента KSI, настроенными на умеренные и высокие температуры, существует простой и легко проходимый эволюционный маршрут. Им неоднократно пользовались самые разные группы бактерий. Это оказалось возможным как раз благодаря слабому эпистазу, то есть тому факту, что конкретная аминокислотная замена приводит к одному и тому же результату вне зависимости от контекста. К этому выводу авторы пришли, проанализировав данные по тысячам видов бактерий. Оптимальные для этих видов температуры сопоставлялись с аминокислотными последовательностями KSI и с положением этих видов на эволюционном дереве. Выяснилось, что адаптация мезофильных бактерий к более высоким температурам часто сопровождалась заменой D103S. И наоборот, когда термофилы вдруг решали переселиться в места попрохладнее, с большой вероятностью происходила замена S103D. Три «дополнительные» позиции (86, 88 и 101) тоже обычно подтягивались к состоянию, оптимальному для данных температурных условий. Всё это происходило много раз независимо в разных эволюционных линиях.

Авторам удалось даже в общих чертах разобраться, почему замена аспарагиновой кислоты на серин в позиции 103 снижает активность, но повышает стабильность фермента. Для высокой активности нужно, чтобы аминокислотный остаток образовывал сильную водородную связь с субстратом. Это у аспарагиновой кислоты получается лучше, чем у серина (рис. 1, внизу). Стабильность же требует, чтобы аминокислотный остаток был в протонированном состоянии, то есть заканчивался группой -OH, а не -O⁻. У аспарагиновой кислоты с этим проблемы (она же всё-таки кислота), а у серина — нет.

Таким образом, слабый эпистаз обеспечивает существование простого и универсального эволюционного маршрута между версиями KSI, приспособленными к разным температурам. Это, в свою очередь, приводит к многочисленным случаям параллельной эволюции.

Чтобы понять, насколько общей является эта закономерность, авторы проанализировали данные по 2194 семействам ферментов у 5852 видов бактерий, для которых известны геномы и оптимальные температуры. Для каждого фермента, каждой аминокислотной позиции в этом ферменте и каждой из 20 аминокислот, которые в принципе могут стоять в этой позиции, ученые искали связь с температурой. Иными словами, был проведен целенаправленный поиск позиций, в которых частота встречаемости тех или иных аминокислот достоверно зависит от температуры. Если слабый эпистаз, наличие стандартных эволюционных маршрутов и многочисленные параллелизмы — общие правила температурной адаптации ферментов, то следует ожидать, что таких «температурозависимых» позиций и аминокислот найдётся очень много.

Это ожидание подтвердилось. Как минимум одна температурозависимая позиция нашлась почти у половины ферментов (1005 из 2194). Судя по тому, как аминокислоты, стоящие в этих позициях, распределены по эволюционному дереву, параллелизмы в эволюции этих ферментов происходили сплошь и рядом.

Остальные 1189 ферментов, очевидно, не нашли универсальных (то есть не подвластных эпистазу) путей температурной адаптации. Они, наверное, делают это другими способами, не такими универсальными, а подходящими только для определенных аминокислотных контекстов. Но в данном исследовании речь не о них.

В общей сложности исследователи нашли более 158 тысяч статистически значимых ассоциаций между температурой и определенной аминокислотой в определенной позиции определенного фермента. Один из примеров показан на рис. 3.

Рис. 3. Пример стандартного эволюционного маршрута температурной адаптации: позиция 452 фермента фосфат-ацетилтрансферазы (PAT). Фермент функционирует в виде гомодимера, то есть комплекса из двух одинаковых белковых молекул. Его структура показана слева. Аминокислота в позиции 452 участвует в соединении половинок. Графики показывают, что по мере увеличения оптимальной температуры роста (T_Growth) снижается вероятность того, что в данной позиции обнаружится треонин (T) или аспарагин (N), и растет вероятность того, что там будет стоять изолейцин (I). Эволюционное дерево (справа) показывает, что разные аминокислоты в позиции 452 (цветные точки на концах ветвей) распределены по дереву хоть и не совсем хаотично, но и без строгой приуроченности определенных аминокислот к определенным ветвям. Это значит, что в эволюции данного фермента было много параллелизмов. Изображение из обсуждаемой статьи в Science

В итоге получился внушительный массив данных по стандартным (высоковероятным) путям температурной адаптации ферментов. В этом массиве еще долго можно будет искать всякие интересные закономерности. Некоторые из них уже найдены авторами и описаны в обсуждаемой статье. Вот один пример. Ранее уже высказывалась идея, что эволюция термоустойчивости белков может сопровождаться ростом частоты встречаемости аминокислотных остатков с разветвленными цепями (изолейцина, лейцина и валина) в гидрофобной сердцевине белковой молекулы. Разветвленные цепи скрепляют ее наподобие клея. Новые данные показали, что частота встречаемости изолейцина действительно растет с увеличением температуры, но для лейцина и валина такой закономерности обнаружить не удалось. Видимо, это значит, что изолейцин является более универсальным (контекстно-независимым) клеем, чем лейцин и валин. Более того, оказалось, что две самые частые аминокислотные замены, происходящие при адаптации ферментов к высокой температуре — это замены лейцина и валина на изолейцин. Авторы предполагают, что изолейцин склеивает белковую молекулу лучше, чем валин, так как у него длиннее гидрофобная боковая цепь, и лучше, чем лейцин, потому что эта цепь у него асимметрична, может по-разному поворачиваться и легче встраивается в разнообразные пустоты во внутренней части белковой молекулы.

Обнаруженные авторами стандартные пути температурной адаптации ферментов иногда представляют собой единичные аминокислотные замены, но во многих случаях речь идет о согласованной замене двух или более аминокислот. Такое должно чаще происходить с аминокислотами, которые как-то взаимодействуют друг с другом, а значит, в трехмерной белковой молекуле они должны находиться по соседству (примерно как позиции 103, 86 и 101 у фермента KSI, см. рис. 1). Целенаправленный поиск таких контактирующих и при этом согласованно меняющихся групп аминокислот позволил обнаружить их более чем у половины (525 из 1005) ферментов, имеющих хотя бы одну температурозависимую позицию. В большинстве случаев это пары, но встречаются и тройки, и более многочисленные группы взаимодействующих аминокислот, имеющих обыкновение согласованно меняться в ходе температурной адаптации.

Обсуждаемая работа имеет как теоретическое, так и практическое значение. Составленная авторами база данных по аминокислотным заменам, ассоциированным с температурной адаптацией, будет полезна при проектировании искусственных белков с заданными свойствами. С теоретической точки зрения важен вывод о том, что температурная адаптация часто (хоть и далеко не всегда) идет по стандартным, высоковероятным эволюционным маршрутам, универсальность которых обеспечивается слабым эпистазом. Это ведет к бесчисленным параллелизмам: самые разные версии фермента, даже сильно отличающиеся друг от друга по аминокислотной последовательности, раз за разом находят одно и то же простое решение типовой эволюционной задачи.

Источник: Margaux M. Pinney, Daniel A. Mokhtari, Eyal Akiva, Filip Yabukarski, David M. Sanchez, Ruibin Liang, Tzanko Doukov, Todd J. Martinez, Patricia C. Babbitt, Daniel Herschlag. Parallel molecular mechanisms for enzyme temperature adaptation // Science. 2021. DOI: 10.1126/science.aay2784.

См. также о роли эпистаза в эволюции белков:
1) «Альтернативная история» белков проливает свет на роль случайности в эволюции, «Элементы», 18.09.2017.
2) Эволюция белков сдерживается низкой проходимостью ландшафта приспособленности, «Элементы», 09.02.2015.
3) Предсказуемый рост приспособленности достигается непредсказуемыми путями, «Элементы», 30.06.2014.
4) Параллельная эволюция изучена в эксперименте на бактериях, «Элементы», 01.02.2012.
5) В долгосрочном эволюционном эксперименте выявлен отбор на «эволюционную перспективность», «Элементы», 25.03.2011.
6) Расширение белковой вселенной продолжается, «Элементы», 24.05.2010.
7) Пути эволюции предопределены на молекулярном уровне, «Элементы», 12.04.2006.

Александр Марков