Удалось увидеть, как в мозжечке личинок данио-рерио строятся модели взаимодействия тела с внешним миром

Рис. 1. Личинки Danio rerio на седьмой день после оплодотворения. Фото © National Institute of Genetics с сайта akiramuto.net

Если посчитать нейроны в разных отделах мозга, то результат получится неожиданным. Окажется, что в сравнительно небольшом выросте заднего мозга — мозжечке — содержится больше нейронов, чем во всей остальной нервной системе! Наиболее убедительное объяснение этому состоит в том, что в хитросплетениях нейронных связей мозжечка закодированы внутренние модели всего, с чем сталкивается двигательная система организма в течение жизни. Пример такой модели: если напрячь бицепс, то рука согнется. Этот кажущийся самоочевидным факт — на самом деле знание (то есть модель), полученное с опытом. Поскольку таких моделей нужно бесчисленное множество, то и нейронов, лежащих в основе этих моделей, должно быть очень много. Группа нейробиологов из Института Нейробиологии Макса Планка в Мюнхене поставила перед собой цель подтвердить или опровергнуть эту гипотезу о внутренних моделях в мозжечке. Для этого ученые поместили крошечных личинок рыбок Danio rerio в виртуальную реальность, где они выполняли двигательную задачу, для которой требуется мозжечок. Эти личинки настолько маленькие, что они целиком умещаются под объективом микроскопа. А значит, можно наблюдать активность всех нейронов в мозге, пока рыбки выполняют свою задачу. Авторам удалось увидеть — в прямом смысле этого слова — признаки существования внутренних моделей в нейронной активности мозжечка. Поскольку личинки находились на очень раннем этапе развития (как онто-, так и филогенетически), результаты указывают на то, что внутренние модели — это первичная и самая древняя функция мозжечка, в свете которой и следует рассматривать эту структуру мозга.

Если закрыть глаза и представить себе архетипичный нейрон, то в уме скорее всего возникнет нечто древовидное, как на рис. 2. Разветвленное дерево дендритных отростков, тело нейрона и длинный, уходящий вдаль, аксон. На самом деле, нейроны выглядят по-разному, и такое великолепное дендритное древо — это отличительная черта вполне конкретного и очень интересного типа нейронов — клеток Пуркинье. Эти клетки находятся в мозжечке и играют там ключевую роль. Являются, если можно так выразиться, его сердцем. (Тут есть небольшой каламбур, связанный с тем, что в сердце тоже есть клетки, называющиеся клетками Пуркинье, но они не имеют никакого отношения к мозжечку.)

Рис. 2. Микроархитектура мозжечка. Видны клетки Пуркинье с их шикарными дендритными деревьями (A) и маленькие гранулярные клетки (B). Рисунок Сантьяго Рамон-и-Кахаля с сайта en.wikipedia.org

Еще со времен Сантьяго Рамон-и-Кахаля, впервые рассмотревшего и зарисовавшего микроструктуру мозжечка, эта часть мозга привлекала нейробиологов изящной красотой своей архитектуры. Ведь действительно, такие деревья не вырастают просто так. Их разветвленность подсказывает, что клетки Пуркинье получают колоссальное число входных сигналов, собирая информацию от сотен тысяч других нейронов — гранулярных клеток. Эти клетки тоже особенные. Во-первых, каждая гранулярная клетка посылается сигналы к тысячам клеток Пуркинье. Остается только поразиться колоссальному числу внутримозжечковых межнейронных связей. И во-вторых, этих гранулярных клеток в мозжечке больше, чем всех других нейронов во всей нервной системе вместе взятой (около 50 миллиардов, в то время как суммарное число нейронов мозга оценивают примерно в 85 миллиардов). Это говорит о том, что мозжечок выполняет нечто фундаментально важное в жизни позвоночных, нечто, на что нужно больше половины всех нейронов нервной системы!

Функцию мозжечка чаще всего связывают с координацией движений, сложным контролем позы тела, поддержанием правильного мышечного тонуса и моторным обучением. Однако, чтобы понять, как работает мозжечок, нужно ответить на вопрос, как эти общие и весьма размыто сформулированные функции мозжечка выводятся из его внутреннего устройства. Например, зачем для выполнения перечисленных функций нужно так много нейронов? Одна из наиболее общепризнанных гипотез состоит в том, что мозжечок служит нейронной основой для так называемых внутренних моделей (см. Internal model (motor control)). Суть этих моделей в том, что, совершая то или иное движение, мы неизбежно ощущаем его последствия. Например, напрягая мышцы, поднимающие руку вверх, мы видим, как рука поднимается вверх. Поскольку это происходит раз за разом, взаимодействие между движением и его последствиями можно предсказать, или, что то же самое, сформировать модель этого взаимодействия. Это нужно для выполнения двух фундаментальных задач двигательного контроля. Во-первых, для предсказания результатов движений. Такие внутренние модели, действующие по принципу «действие — результат», в теории контроля называются прямыми. И во-вторых, для того, чтобы определить, какое движение требуется для достижения того или иного результата. Такие модели «результат — действие» называют обратными. Из сочетания работы прямых и обратных внутренних моделей и складывается то, что мы называем координацией движений, поддержанием позы, и т. п.

Стоит отметить, что речь идет исключительно о бессознательном двигательном контроле. Приведу наглядный пример. Поднимая вбок правую руку, мы тем самым переносим центр тяжести вправо и рискуем упасть. Именно это происходит с ребенком, когда он учится стоять. Он пока не знает, что происходит с его центром тяжести при тех или иных движениях, у него еще нет соответствующей прямой модели «поднял руку — упал» (а точнее, «поднял руку — ощутил удар полом по голове»). Однако по мере тренировки в хитросплетениях связей мозжечка, согласно гипотезе, необходимая модель формируется, и ребенок учится предсказывать, что он упадет, подняв руку. Теперь он может напрячь мышцы ног так, чтобы заранее перенести вес влево и предотвратить падение. Для этого, в свою очередь, нужна соответствующая обратная модель, связывающая перемещения центра тяжести с напряжением мышц ног. Итак, нужные связи в мозжечке изменились, произошел акт моторного обучения, сформировалась и усовершенствовалась внутренняя модель — ребенок научился стоять. При этом нам не нужно постоянно думать о том, как нам переносить вес, чтобы не упасть, когда мы двигаем руками, — эту работу за нас делает мозжечок.

А вот при повреждениях мозжечка зачастую приходится именно думать о совершаемых движениях. Бессознательная и тонко отлаженная работа внутренних моделей замещается неуклюжим и медлительным сознательным контролем.

Один из характерных симптомов некоторых поражений мозжечка — это тремор и неспособность вовремя остановиться при движении конечности к определенной целевой точке. Если больного попросить поднести руку к нарисованной черте, то, во-первых, рука будет трястись по время движения, а во-вторых, человек пронесет руку слишком далеко, за цель. Это можно объяснить тем, что у такого пациента нарушены внутренние модели, и он не может рассчитать требуемое движение заранее. Вместо этого ему приходится контролировать движение по мере выполнения, руководствуясь сигналами обратной связи от глаз или мышц в руке. Однако по объективным причинам сенсорная обработка в нервной системе идет очень медленно и в результате, когда информация о том, где сейчас находится рука, дойдет до мозга, рука уже успеет сдвинуться вперед. Чтобы вернуть ее на место, мозг посылает сигнал сдвинуться назад, потом — опять вперед и т. д. Так и получается тремор. И когда трясущаяся рука наконец подходит к цели, информация об этом доходит до мозга слишком поздно, и рука успевает продвинуться дальше, за цель.

В свете идеи о внутренних моделях становится понятно, почему колоссальное количество нейронов и межнейронных связей в мозжечке абсолютно необходимо. Дело в том, что при обучении чему-то одному нам важно не разучиться делать то, чему мы обучились раньше. А значит, на каждую мыслимую и немыслимую ситуацию должна найтись своя уникальная и неповторимая комбинация нейронных связей, в которой и будет закодирована внутренняя модель, необходимая для данной конкретной ситуации. Сила комбинаторики!

Группа ученых из Института Нейробиологии Макса Планка в Мюнхене (Max Planck Institute of Neurobiology), в которую входил и автор этой новости, поставила перед собой задачу подтвердить или опровергнуть гипотезу о внутренних моделях в мозжечке. Также нам хотелось понять, является ли эта функция первичной для мозжечка. Иными словами, можно ли действительно считать внутренние модели ключом к пониманию самой сути мозжечка или же эта функция, если она действительно присуща мозжечку, является как минимум вторичной?

Рис. 3. Мозг личинки Danio rerio с выделенным мозжечком. 1 — передний мозг, 2 — средний мозг, 3 — мозжечок, 4 — продолговатый мозг, 5 — спинной мозг. Длина масштабного отрезка — 100 мкм. Рисунок автора

Для ответа на эти вопросы мы использовали очень интересный модельный организм — личинок рыбок Danio rerio (рис. 1). Эти личинки крошечные — всего 4 мм в длину — и прозрачные. Благодаря этому их мозг полностью помещается под объектив микроскопа, и при использовании методов функциональной визуализации можно записывать активность всех нейронов мозга одновременно (видео 1)! Кроме того, они обладают богатым поведенческим репертуаром: личинки данио умеют плавать, охотиться, обладают разнообразными рефлексами и даже умеют немного обучаться. И что особенно важно для нас — они полноценные члены клуба позвоночных, обладающие теми же отделами мозга, что и мы, включая, конечно, и мозжечок (рис. 3). Только мозг у них очень маленький, и в нем гораздо меньше нейронов, чем у нас: всего лишь около сотни клеток Пуркинье против наших десятков миллионов. И мы предположили, что, если даже в таком миниатюрном и простом мозжечке, к тому же столь молодом фило- и онтогенетически, удастся обнаружить следы внутренних моделей, это будет убедительно говорить в пользу первичности этой функции.

Чтобы проследить активность нейронов мозжечка у личинок данио под микроскопом, нужно их, во-первых, обездвижить, и, во-вторых, заставить решать какую-то двигательную задачу, в которой ярко проявилась бы функция мозжечка. С обездвиживанием просто: можно поместить рыбку в желе из агарозы и аккуратно убрать желе вокруг хвоста, чтобы голова осталась зафиксированной, а хвост мог двигаться. Это позволяет наблюдать поведение обездвиженных рыбок и потом сопоставить его с нейронной активностью. Кстати, это еще одна сильная сторона личинок Danio rerio как модельного объекта: они могут долго жить в обездвиженном виде. Взрослым рыбам нужно все время плавать, чтобы прогонять воду через жабры и дышать, — они быстро задохнутся в агарозе. А миниатюрным личинкам достаточно воздуха, попадающего в кровь через кожу, даже если они обездвижены.

Итак, мы поместили таких обездвиженных рыбок в специальную установку, показанную на рис. 4. Там с помощью проектора им показывали зрительный стимул: движущиеся вперед черные и белые полоски, проецируемые на предметный столик под рыбкой. Так как стимул движется вперед относительно рыбки, ей кажется, что она движется назад. Такой стимул вызывает так называемый оптомоторный ответ, в ходе которого рыбка начинает двигать хвостом, чтобы проплыть вперед и компенсировать ощущение движения назад.

Рис. 4. Схема эксперимента с виртуальной реальностью. Заключенная в агарозу личинка Danio rerio (1) помещается в установку. С помощью проектора (2) и зеркала (3) ей показывают движущийся вперед зрительный стимул — чередующиеся черные и белые полоски (4). Направление движения показано фиолетовой стрелкой. В ответ на такой движущийся стимул рыбка двигает хвостом (оптомоторный ответ, зеленая стрелка). Движения хвоста фиксируются с помощью камеры (5) и информация об этом движении передается через компьютер по петле обратной связи (6) обратно проектору. Справа показаны кадры, записанные на камеру. Длина масштабного отрезка — 1 мм. Рисунок из обсуждаемой статьи в Nature Communications

Поскольку рыбка обездвижена, она, конечно же, не может продвинуться вперед, однако тут мы можем применить хитрость и обмануть рыбку. Мы снимаем движения хвоста на камеру, мгновенно рассчитываем из этих движений, с какой скоростью рыбка плыла бы, если бы не была обездвижена, и меняем скорость движения полосок в соответствии с этим расчетом. В результате обездвиженной рыбке кажется, что, когда она двигает хвостом, она действительно продвигается вперед. Фактически, обездвиженная рыбка плавает в виртуальной реальности (видео 2). Самое главное здесь то, что мы можем контролировать формулу, определяющую, как движения хвоста превращаются в скорость рыбки. Мы можем сделать ее быстрее или медленнее, или, скажем, сделать так, чтобы мир откликался на плавательные движения с задержкой. Представьте, что вы делаете шаг, чтобы продвинуться на метр вперед, и ожидаете, что мир в ответ продвинется на метр назад, а он это делает почему-то с задержкой. Именно это происходило с нашими рыбками (видео 2).

Как видно на видео 2, личинки Danio rerio плавают короткими рывками. Оказалось, что если ввести задержку отклика, то эти рывки станут длиннее (рис. 5, черные линии). Можно представить, что, начав делать шаг и не увидев ожидаемого движения мира назад, вы начнете этот шаг удлинять пока мир, наконец, не сдвинется. Во всяком случае, как видно на рис. 5, именно это делали рыбки. Мы предположили, что подобная двигательная адаптация в ответ на изменение взаимосвязи между движением и последствием этого движения — это как раз функция мозжечка. Чтобы в этом убедиться, мы создали специальных трансгенных рыбок, у которых можно убить все клетки Пуркинье фармакологическим методом (см. S. Curado et al., 2008. Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies). К нашему удивлению, оказалось, что даже такие рыбки с поврежденным мозжечком отлично «удлиняют свой шаг» (рис. 5, оранжевые линии). Тогда мы стали искать какие-то другие последствия удаления мозжечка. Рыбки без мозжечка внешне никак не отличались от контрольной группы, отлично плавали, охотились на артемий, крутили глазами, и, в общем, делали все, что положено делать маленьким рыбьим личинкам. Они даже взрослели и начинали размножаться. Возникало впечатление, что личинкам мозжечок просто не нужен, что, возможно, он находился на стадии формирования и обретал функцию только и взрослых рыб, и что, короче говоря, наш проект зашел в тупик.

Рис. 5. Реакция личинок на задержку отклика. Чем длиннее задержка, тем длиннее плавательные рывки. Бесконечная задержка означает, что стимул вообще не начинает двигаться назад после движений хвоста. Рисунок из обсуждаемой статьи в Nature Communications

А потом мы заметили, что если рыбкам в виртуальной реальности изменить связь между движениями и их последствиями, введя задержку отклика надолго, то происходит нечто интересное. Постепенно рыбки начинают все меньше и меньше реагировать на это изменение, и в какой-то момент их поведение перестает отличаться от контрольной группы с нормальным не задержанным откликом (рис. 6, слева). Мы назвали это долгосрочной адаптацией. Рыбки как будто привыкают, что теперь (почему-то) мир реагирует на их движения по-новому (с задержкой), и, возможно, им не следует так бурно на это каждый раз реагировать. Неожиданное становится привычным. Возможно, что некая внутренняя модель происходящего изменяется в ходе долгосрочной адаптации, и рыбки начинают ожидать задержку отклика. И действительно, долгосрочная адаптация оказалась значительно ослабленной у рыбок с поврежденным мозжечком: они упорно продолжали «удлинять шаг» (рис. 6, справа)!

Рис. 6. Результаты эксперимента с долгосрочной адаптацией. Голубым показан период эксперимента, когда группа «долгосрочная адаптация» привыкала к задержке отклика. Контрольная группа при этом наслаждалась нормальным привычным откликом. Когда задержка отклика была еще непривычной (повтор 21), рыбки, как и на рис. 5, удлинили свои плавательные рывки. Однако потом рыбки со здоровым мозжечком привыкли к задержке, и к повтору 230 их поведение стало неотличимо от контрольной группы (показано салатовой стрелкой). Когда условия вновь поменялись на нормальные, продолжительность рывков стала короче, чем у контрольной группы (оранжевая стрелка). Это говорит о том, что что-то внутри мозга перестроилось за время долгосрочной адаптации, и рыбки стали по-другому себя вести в нормальных условиях. Важно, что после повреждения мозжечка этих эффектов не наблюдалось: рыбки продолжали реагировать на задержку отклика даже к повтору 230, и были неотличимы от контроля, когда условия вернулись в норму. Графики из обсуждаемой статьи в Nature Communications

Оставался последний шаг: нужно было записать активность нейронов мозжечка и убедиться, что в этой активности можно обнаружить следы обучающейся внутренней модели. Для этого мы повторили эксперимент с долгосрочной адаптацией на трансгенных рыбках, у которых в клетках Пуркинье выделялось специальное вещество (см. GCaMP), которое ярко флуоресцирует, когда в клетке много кальция. Поскольку кальций является индикатором нейронной активности, по свечению клеток в микроскопе можно судить об их активности.

Мы провели эксперимент по долгосрочной адаптации рыбок под микроскопом и проанализировали активность клеток Пуркинье в ходе адаптации. Клетки были разделены на несколько типов в зависимости от того, как они вели себя в течение адаптации, и сравнили встречаемость каждого типа у группы рыб, прошедших долгосрочную адаптацию, с контрольной группой. Оказалось, что единственный тип клеток с достоверно различимой встречаемостью, во-первых, встречался чаще у адаптировавшихся рыб (порядка 10% всех клеток Пуркинье) и, во-вторых, вел себя следующим образом. Когда рыбки впервые столкнулись с еще не привычной задержкой отклика, активность клеток не изменилась. По мере того, как рыбки постепенно привыкали к задержке, активность этих клеток постепенно уменьшалась. Когда задержка отклика внезапно исчезла, активность клеток не изменилась и осталась низкой, однако по мере привыкания к изначальным условиям без задержки, активность клеток этого типа постепенно вернулась к изначальному уровню. Именно так, по идее, и должен выглядеть выходной сигнал постепенно обучающейся внутренней модели, предсказывающей последствия собственных движений хвоста: сначала постепенное привыкание к новым условиям, потом постепенное отвыкание, когда условия вернулись в норму.

Основной интерес этой работы не в том, что она показывает наличие внутренних моделей в мозжечке. Никто в этом и так особо не сомневался — слишком уж хорошо все факты укладываются в эту теорию. И даже не в том, что эти внутренние модели удалось увидеть, в прямом смысле этого слова — глазами в микроскоп. А главное, на мой взгляд, в том, что внутренние модели удалось проследить даже в крошечном мозжечке личинки нескольких дней от роду, в котором только-только закончили формироваться основные мозжечковые связи (как в онтогенетическом смысле, так и в филогенетическом). Это указывает на то, что, видимо, именно внутреннее моделирование является первичной, самой древней и центральной функцией мозжечка, в свете которой и следует рассматривать эту структуру мозга. Изначально мозжечок появился, чтобы обеспечивать сложное взаимодействие вестибулярной и глазодвигательной систем. И использованный при этом принцип внутреннего моделирования, основанный на архитектуре многочисленных связей между гранулярными клетками и клетками Пуркинье, оказался настолько удачной находкой эволюции, что мозжечок разросся и впоследствии стал применять этот принцип далеко за пределами контроля движений, включая, например, и когнитивные функции. Но в нейронной основе этих функций лежат все те же клетки Пуркинье с их великолепными дендритными деревьями, все та же сила комбинаторики внутримозжечковых связей и все те же внутренние модели.

Источник: Daniil A. Markov, Luigi Petrucco, Andreas M. Kist & Ruben Portugues. A cerebellar internal model calibrates a feedback controller involved in sensorimotor control // Nature Communications. 2021. DOI: 10.1038/s41467-021-26988-0.

Даниил Марков