Борис Жуков
«Что нового в науке и технике» №10, 2005

Сеанс игры вслепую

Agrobacterium tumefaciens поражает стебли и листья некоторых растений, причем ее Ti-плазмиды умеют встраивать часть своей ДНК в хромосому растительной клетки (на фото вверху). Получив такой подарок, клетки начинают бурно делиться, превращаясь в разрастание рыхлой ткани — корончатый галл (на фото внизу), и вырабатывать ряд экзотических веществ, которыми и питаются трансформировавшие их бактерии. Для человека Ti-плазмиды ценны именно тем, что умеют не просто доставлять нужные гены в растительную клетку, но и встраивать их внутрь ее родных хромосом (изображение с сайтов www.genomenewsnetwork.org и oregonstate.edu)

Agrobacterium tumefaciens поражает стебли и листья некоторых растений, причем ее Ti-плазмиды умеют встраивать часть своей ДНК в хромосому растительной клетки (на фото вверху). Получив такой подарок, клетки начинают бурно делиться, превращаясь в разрастание рыхлой ткани — корончатый галл (на фото внизу), и вырабатывать ряд экзотических веществ, которыми и питаются трансформировавшие их бактерии. Для человека Ti-плазмиды ценны именно тем, что умеют не просто доставлять нужные гены в растительную клетку, но и встраивать их внутрь ее родных хромосом (изображение с сайтов www.genomenewsnetwork.org и oregonstate.edu)

Сразу, как только это выяснилось, у ученых возник соблазн поиграть в генетический конструктор: взять ген из одного организма и перенести в другой. Но легко сказать «взять и перенести» — каждая «буква», которыми записан генетический текст, состоит всего из нескольких атомов. Объекты такого размера нельзя увидеть ни в какой микроскоп — их размер намного меньше длины световой волны. А ведь нужно было не только опознать в клетке определенный ген, но и аккуратно вырезать его, перенести внутрь другой клетки, вставить в одну из ее хромосом. И еще сделать так, чтобы он там попал в «считывающее устройство» — ведь в каждый момент в клетке работают лишь немногие из имеющихся в ней генов, и мы до сих пор не вполне понимаем, как она выбирает, какие гены считывать. На обзаведение инструментами, позволяющими хотя бы приступить к решению этих задач, у молекулярной биологии ушло почти двадцать лет.

Первый шаг к созданию трансгенного организма — это определение «донорского» гена. Само по себе это не так уж просто: если, скажем, нас интересует производство какого-нибудь вещества — ну, например, аминокислоты триптофана, — нужно выделить и очистить фермент, который его делает, определить его аминокислотную последовательность, «вычислить» по ней последовательность нуклеотидов в соответствующем гене (что не так-то просто: одну аминокислоту могут кодировать несколько сочетаний нуклеотидов) и найти этот ген. Впрочем, соответствие между интересующим разработчика продуктом и ответственным за него геном можно установить и другими путями, и множество генов было идентифицировано еще до возникновения трансгеники. Что до их расшифровки, то с этой задачей, за решение которой в 70-е годы давали Нобелевские премии, сегодня успешно справляется автоматика.

Но вот нужный ген опознан, прочитан, установлено его место в геноме донора. Теперь надо его вырезать. С этого и начинается собственно генная инженерия. Ножницами для вырезания нужного гена служат специальные ферменты-рестриктазы. Вообще-то ферментов, умеющих разрезать нить ДНК, очень много, но рестриктазы рассекают ее по строго определенному сочетанию букв-нуклеотидов — своему для каждой рестриктазы (а их известно сейчас более сотни). Конечно, никто не гарантирует, что границы интересующего нас участка будут отмечены каким-либо из этих ключевых сочетаний, но, зная текст искомого гена, можно так выбрать рестриктазы, чтобы среди нарезанных ими кусочков были и те, что содержат его целиком. Кроме него в состав этих фрагментов будут, вероятно, входить обрезки соседних участков ДНК, но их можно убрать экзонуклеазами — ферментами, откусывающими по одному нуклеотиду с конца нити ДНК.

Впрочем, в последнее время появился способ скопировать нужный участок, не вырезая его, — полимеразная цепная реакция. Для нее достаточно иметь лишь затравку — маленький кусочек ДНК, соответствующий началу нужного гена. При определенных условиях эта затравка может послужить сигналом для фермента полимеразы — снять копию с гена, начинающегося этим фрагментом. Мало того — когда копия будет готова, полимеразы примутся снимать копии и с нее, и с участка, послужившего ей образцом. Копии начнут множиться лавинообразно, пока в системе не исчерпается запас свободных нуклеотидов. Это выглядит примерно как если бы в собрание сочинений Пушкина подкинули россыпь печатных букв и клочок бумаги с единственной строчкой «У лукоморья дуб зеленый...» — а через короткое время получили бы несколько сот экземпляров полного текста пролога к «Руслану и Людмиле»!

Но вот нужный ген так или иначе выделен. Теперь надо его упаковать в конверт, который доставит его внутрь чужой клетки. Обычно для этого используются природные переносчики генетической информации — вирусы и плазмиды. Последние представляют собой небольшие кольцевые молекулы ДНК, существующие в бактериальных клетках отдельно от их основного генома. Они способны проникать из одной клетки в другую и служат бактериям чем-то вроде почтовых вирусов, позволяя им передавать друг другу полезные признаки — например, устойчивость к тому или иному антибиотику. Именно эта способность переносить гены из клетки в клетку и сделала плазмиды излюбленным инструментом генной инженерии.

Особенно удобны так называемые Ti-плазмиды, получаемые из микроорганизма Agrobacterium tumefaciens. Эта бактерия поражает стебли и листья некоторых растений, причем ее Ti-плазмиды умеют встраивать часть своей ДНК — несколько генов — в хромосому растительной клетки. Получив такой подарок, клетки начинают бурно делиться, превращаясь в разрастание рыхлой ткани (корончатый галл), и вырабатывать ряд экзотических веществ, которыми и питаются трансформировавшие их бактерии (для прочих почвенных микроорганизмов эти вещества несъедобны). По сути дела, бактерия выступает здесь как биотехнолог, вводя в геном растения гены полезных для себя признаков. Для человека же Ti-плазмиды особенно ценны именно тем, что умеют не просто доставлять нужные гены в растительную клетку, но и встраивать их внутрь ее родных хромосом.

Однако вирусы и плазмиды почти никогда не используются в биотехнологии в своем натуральном виде. Например, Ti-плазмида содержит гены растительных гормонов, заставляющих клетки растения разрастаться в рыхлую опухоль и не дающих им специализироваться — в то время как разработчики должны вырастить из генно-модифицированной клетки целое растение. Другие гены Ti-плазмиды кодируют ферменты, синтезирующие бактериальную еду — если их оставить, часть ресурсов будущего трансгенного растения будет уходить на производство этих ненужных человеку веществ. Кроме того, все эти гены занимают место, а оно в генетических «конвертах» дорого — увеличение размера участка ДНК, который надо доставить в клетку-мишень, резко снижает вероятность успеха. Так что перед использованием из Ti-плазмиды (как и из любого другого генетического переносчика) уже знакомыми нам инструментами вырезается всё лишнее — остаются только гены, обеспечивающие доставку «груза» по назначеннию.Такие искусственные конструкции для переноса генов на биотехнологическом жаргоне называются «векторами». Иногда, впрочем, в процессе превращения плазмиды или вируса в вектор в них кое-что и добавляют. Так, например, в векторы, созданные на основе Ti-плазмиды, добавлены регуляторные участки, позволяющие им размножаться в клетках кишечной палочки, выращивать которую в лаборатории куда проще, чем Agrobacterium tumefaciens, питающийся редкими аминокислотами.

Векторы, созданные из природных переносчиков генетической информации, решают за конструкторов еще одну задачу. Как уже говорилось, мало перенести нужный ген в другую клетку — надо еще, чтобы он там начал работать. У каждого организма есть тонкая и сложная система регуляции активности генов, следящая за тем, чтобы работали лишь те гены, продукт которых необходим в данный момент. Продукт же чужого гена клетке не нужен по определению, и никаких резонов считывать этот ген у нее нет.

С той же проблемой столкнулись когда-то и вирусы, для которых это вопрос жизни и смерти: не убедив клетку немедленно начать их считывать, они не смогут размножиться. Поэтому структурные гены вируса снабжены промотором — участком ДНК, который ферментными системами клетки воспринимается как команда начать считывание. Промотор — обычный элемент любого генетического аппарата, свои промоторы есть и у клетки-хозяина, которая регулирует активность генов, открывая и закрывая их промоторы для считывающих ферментов. Однако вирусные промоторы не подчиняются клеточным регуляторам и всегда открыты для ферментов. Так же ведут себя промоторы вышеупомянутой Ti-плазмиды. При этом один промотор заставляет клетку считывать целый ряд примыкающих к нему генов. Вектор с таким промотором не только вставляет нужные генетические тексты в геном клетки-мишени, но и заставляет ее немедленно приступить к их чтению.

Закладка «письма» в «конверт» происходит так: вектор, физически представляющий собой кольцевую молекулу ДНК, разрезают в нужном месте рестриктазами, приводят в контакт с копией выделенного гена и добавляют сшивающий фермент — лигазу. Она соединяет два отрезка ДНК — ген и вектор — снова в колечко. Теперь остается только внедрить полученную рекомбинантную ДНК в клетку-мишень. Как мы уже знаем, векторы умеют делать это сами, но им можно помочь, повысив проницаемость клеточной мембраны с помощью некоторых солей или электрического тока. Если мишенью является бактерия, то не обязательно даже встраивать нужный ген в основной геном — он может работать и в плазмиде-векторе...

Тут возникает очередная трудность: молекулярные конструкторы работают сразу с большим количеством объектов — генов, векторов, клеток-мишеней. Понятно, что каждая операция имеет не стопроцентный выход, и в итоге далеко не все клетки-мишени получают донорский ген. Трансгенные клетки нужно отделить от неизмененных. Для этого еще при создании рекомбинантной ДНК в вектор вместе с нужным геном встраивают ген устойчивости к какому-нибудь антибиотику. А после воздействия таких векторов клетки-мишени высевают на питательную среду, содержащую этот антибиотик. Тогда все клетки, в которые вектор не внедрился или не работает, погибнут, и останутся только трансгенные.

Если объектом работы были микроорганизмы, то задача выполнена: создана популяция трансгенных клеток, которые теперь нужно только размножить. С растениями сложнее: из культуры клеток надо вырастить целостный организм. Но делать это растениеводы научились задолго до появления генной инженерии. Сложнее всего с животными: у них генной модификации приходится подвергать оплодотворенные яйцеклетки, причем при работе с млекопитающими их еще надо потом имплантировать суррогатной матери. Именно поэтому трансгенных животных создано во много раз меньше, чем растений и микробов. А до массового коммерческого разведения пока не дошло ни одно. Впрочем, последнее обстоятельство, возможно, имеет и другие причины.


0
Написать комментарий

    Элементы

    © 2005–2025 «Элементы»