Какая вакцина лучше?

Для решения этой задачи можно посмотреть, какие вакцины существуют для похожих болезней и какая у них эффективность. Почему исследователи продолжают разрабатывать новые типы вакцин (рекомбинантные вакцины, ДНК- и РНК-вакцины) и для каких болезней разработаны или находятся в разработке вакцины нового типа?

Попробуйте посмотреть на всю последовательность создания вакцины. От разработки и клинических исследований до масштабирования производства, хранения вакцины и процесса вакцинации. Какие способы будут особенно сложны и/или опасны в производстве? Какие способы производства легко масштабировать, а какие — не очень?

1. Гипотетический вирус, эндемичный для небольшой, но экономически важной области, который передается через укусы животных и вызывает поражение эндотелия и, вероятно, клеток крови. Известно, что вирус мутирует медленно.

В случае вирусов, к сожалению, мы далеко не всегда достаточно защищены антителами. Антитела вырабатываются к белкам оболочки вирусной частицы. Они связываются со своими антигенами и делают вирусные частицы видимыми для разных компонентов иммунной системы. При этом не все антитела, которые вырабатывает организм, являются нейтрализующими антителами (см. Neutralizing antibody), которые мешают проникать вирусу в клетку. Если вирус «нырнул» в клетку, он стал невидимым для антител, а уничтожить его можно теперь только вместе с клеткой. Для того чтобы у иммунной системы была такая возможность, клетка демонстрирует фрагменты вирусных белков длиной в 8–10 аминокислот  на MHC-I (см. Антигенпрезентирующие клетки). Цитотоксические CD8+ T-клетки (цитотоксические Т-лимфоциты, или Т-киллеры) используют Т-клеточные рецепторы и сканируют MHC-I с выставленными на них пептидами. Они не реагируют или слабо реагируют на фрагменты наших собственных белков (во время обучения в тимусе Т-клетки, слишком сильно связывающиеся с фрагментами наших белков, либо погибают, либо становятся регуляторными Т-клетками), но распознают чужие. При встрече с новой инфекцией этот процесс затягивается: сначала наивные Т-лимфоциты с соответствующим Т-клеточным рецептором связываются с MHC-I и фрагментами вируса на мембране дендритной клетки, и только после этого они получают разрешение на убийство (подробнее об этом процессе см. Priming). Если для защиты от вируса недостаточно антител, то хотелось бы индуцировать именно такой иммунный ответ, а для этого антиген нужно доставить в клетку.

В первую очередь стоит попробовать вакцины из очищенных белков или фрагментов белков (и не забыть добавить к ним адъювант, который даст сигнал опасности). Например, вакцина от гепатита B представляет собой очищенный поверхностный антиген вируса гепатита B, который вырабатывают генно-модифицированные дрожжи, с добавлением адъюванта — солей алюминия  (информацию об эффективности этой вакцины в зависимости от возраста человека можно посмотреть в бюллетене ВОЗ, см. Вакцины против гепатита B). Процесс производства таких вакцин достаточно безопасен, проблемной ступенью является очистка белка, которая не бывает идеальной.

Но довольно вероятно, что, чтобы вакцина хорошо защищала, нужно вовлечь в иммунный ответ цитотоксические CD8+ T-клетки. Самый простой и очень старый способ — использовать аттенуированный (ослабленный) живой вирус. Для этого нужно пересевать его в течение многих поколений на культурах клеток животных, чтобы он терял приспособленность к клеткам человека. Большинство традиционных вакцин от вирусов получено именно так.

Этот же способ самый рискованный. Пока вирус пересевают, он может заразить работников. А еще он может вызывать болезнь у людей с ослабленным организмом или подавленным иммунитетом. Поэтому, например, живую аттенуированную вакцину от гриппа применяют только для здоровых людей старше двух и младше 50 лет и не применяют для беременных женщин. А еще есть риск того, что вирус накопит мутации, возвращающие ему его опасные свойства (о том, какие условия способствуют этому для вируса полиомиелита, можно прочитать здесь). Гипотетический вирус, о котором идет речь, не передается воздушно-капельным путем (то есть с ним немного легче работать в лаборатории) и мутирует медленно. Однако на первый взгляд он выглядит достаточно опасным.

Похожи по способу производства (культивирование вируса на живых клетках), но гораздо более безопасны рекомбинантные вакцины, представляющие собой безопасный вирус с встроенными в него фрагментами генов вируса, которые должны вызывать иммунный ответ. Первая и пока единственная одобренная вакцина к вирусу Эбола — rVSV-ZEBOV — представляет собой аттенуированный вирус везикулярного стоматита (см. Indiana vesiculovirus), в котором вместо гена его природного белка оболочки вставлен ген белка оболочки вируса Эбола.

Экономически важная, но маленькая область означает, что способы производства вакцины могут быть не самыми дешевыми (другая сторона этого вопроса — что если по какой-то причине распространение болезни замедлится, то разработка вакцины может быть не доведена до конца, как это случилось с первым SARS и с MERS). Насколько это важно, можно понять по тому, что совсем недавно количество доз вакцины от гриппа было ограничено количеством доступных живых оплодотворенных куриных яиц (теперь появился способ выращивания ослабленного вируса гриппа на культурах клеток млекопитающих, что несколько проще и дешевле (см. How Influenza (Flu) Vaccines Are Made).

2. Гипотетическая бактерия, которая вырабатывает сильнодействующий токсин, очень хорошо передается воздушно-капельным путем и уже замечена на трех континентах.

Эта гипотетическая бактерия похожа на бактерию, вызывающую дифтерию. Главное — нейтрализовать токсин, а для этого надо познакомить с ним в обезвреженной форме иммунную систему и при этом не повредить организм, то есть разработать анатоксин. В случае токсина дифтерийной бактерии традиционный способ обезвредить токсин и не лишить его иммуногенных свойств — это обработать его формалином. Разработка и производство такой вакцины потребует культивирование производящих токсин бактерий, очистку токсина (скорее всего, бактерии будут выделять его в окружающую среду, что удобно), обезвреживание токсина и добавление в вакцину адъюванта, чтобы дать сигнал иммунной системе «здесь что-то не в порядке». Кстати, в АКДС — вакцине, формирующей иммунитет от коклюша, дифтерии и столбняка, — правильный сигнал для иммунной системы обеспечивают не только соединения алюминия, но и убитые бактерии, вызывающие коклюш: крупные частицы с большим количеством чужих белков распознаются иммунной системой как опасность, даже когда не размножаются в организме.

В идеале, для производства лучше не использовать сами вызывающие болезнь бактерии, а модифицировать такие, которые хуже выживают в человеке и в целом плохо выживают вне лаборатории (например, нуждаются в специфических питательных веществах, температуре для культивирования и так далее). Вопрос в том, насколько это можно масштабировать.

3. Сейчас во всем мире стараются разработать вакцину от коронавируса SARS-CoV-19 (ВОЗ регулярно публикует список кандидатов, вот июньская сводка). Разные организации пробуют разные подходы к созданию вакцины — от очищенных фрагментов белков до ДНК- и РНК-вакцин. Как вы думаете, какие варианты могут оказаться наиболее успешными?

За разработку вакцины от вируса, вызвавшего текущую пандемию, взялись более ста организаций, и они пробуют буквально все типы вакцин. Бросается в глаза, что среди вакцин в разработке мало вакцин на основе аттенуированного коронавируса (вероятно, потому что работа с ним опасна), но много рекомбинантных вакцин, в которых безопасный вирус будет нести один-два важных гена или фрагмента генов Sars-CoV-19. Эти вакцины — одни из самых перспективных, так как они вовлекают в защиту цитотоксические Т-клетки. В разработке немало вакцин на основе очищенных вирусных белков или субъединиц. Такие вакцины будут вызывать прежде всего выработку антител, но то, насколько хорошо будут защищать эти антитела, всё еще остается под вопросом.

Во время пандемии появился шанс на быструю разработку и быстрое одобрение у ДНК- и РНК-вакцин: хотя еще ни одна ДНК- или РНК-вакцина не одобрена для применения у людей, несколько таких вакцин находятся на продвинутых стадиях клинических испытаний. Плюсы ДНК- и РНК-вакцин в этом конкретном случае — их масштабируемость (легче произвести сотни миллионы доз ДНК или РНК, чем очищенного белка или рекомбинантных вирусов) и безопасность. Минусы — это то, что ДНК-вакцины подразумевают возможность встраивания чужеродной ДНК в мышечные клетки и требуют специального оборудования для вакцинации (например, путем электропорации). РНК-вакцины дают слабый иммунный ответ, что, возможно, удастся обойти с помощью РНК-вакцин, которые дополнительно реплицируются в клетке, или повторных вакцинаций.

В разработке вакцины необходимо найти баланс между эффективностью и безопасностью. Готовых рецептов и гарантий того, какая вакцина лучше, нет. Иммунная система очень сложна, очень индивидуальна (гены иммунной системы — самые вариабельные гены человека), мы только приближаемся к тому, чтобы более или менее полно описывать процессы, происходящие в организме при встрече с патогеном. В целом, самый эффективный, но и самый рискованный способ развить специфический иммунитет к инфекции — переболеть ею. Риски настолько высоки, что человечество придумало вакцинацию, чтобы их избежать. Распределение рисков с вакцинами за рядом исключений схоже. Самые эффективные и в то же время самые опасные — это ослабленный (аттенуированный) патоген или родственные ему патогены. Самые безопасные на текущий момент — очищенные белки или субъединицы белков — не всегда способны обеспечить защиту должного уровня. Поиск хорошей вакцины — это поиск баланса между эффективностью и рисками, с учетом логистики производства, хранения, транспортировки. Поэтому обычно в разработке одновременно находится много разных типов вакцин к одному и тому же заболеванию.

Бактериальные болезни неплохо лечатся антибиотиками. Оказывается, что и с разработкой вакцин от них всё хорошо — если речь не идет о внутриклеточных бактериях, например о возбудителе туберкулеза. Бактерии, не проникающие в клетки, хорошо видимы для иммунной системы. Вакцины разрабатывают прежде всего против бактерий, которые выделяют опасные токсины (например, возбудители столбняка и дифтерии) и/или которые способны вызывать стремительные осложнения (как менингококк). Вакцины от таких заболеваний делают на основе убитых бактерий, инактивированных токсинов (анатоксинов) или, недавнее достижение, на основе характерных небелковых молекул клеточных стенок бактерий — специфических полисахаридов или липополисахаридов. При этом формируется преимущественно антительный ответ благодаря B-лимфоцитам с помощью CD4+ T-лимфоцитов (подробнее об этом чуть ниже). Интересно, что, например, иммунитет у человека, выжившего после столбняка, не формируется (см. Tetanus на сайте ВОЗ) — опасные для жизни дозы столбнячного токсина обычно недостаточны для формирования стойкого иммунитета! Поэтому столбнячный анатоксин — настоящее спасение.

Специфические молекулы клеточных стенок бактерий — полисахариды или липополисахариды — стали успешным компонентом вакцин лишь недавно. Такие молекулы обычно неплохо стимулируют врожденный иммунитет через толл-подобные рецепторы и частично вовлекают в ответ B-лимфоциты, однако долговременная иммунная память не формируется. Почему? Чтобы сформировались эффективные антитела и долговременная иммунная память, необходимо, чтобы B-лимфоцит «съел» антиген, с которым он связался, расщепил его и выставил фрагменты — цепочки аминокислот — на белках MHC II — а CD4+ T-лимфоцит узнал эти фрагменты своим Т-клеточным рецептором и активировал B-лимфоцит (см. схему на рис. 1). В полисахаридах и липополисахаридах, конечно, нет никаких аминокислотных фрагментов.

Рис. 1. Принцип работы конъюгатной вакцины (см. Conjugate vaccine). Изображение с сайта creative-biolabs.com

Проблема решена созданием конъюгатных вакцин (см. Conjugate vaccine), где небелковая молекула связана с белком-антигеном (нет смысла использовать наши собственные белки — есть смысл использовать белки, вызывающие иммунный ответ). Например, уже используются конъюгатные вакцины от менингококка (Neisseria meningitidis). В них специфический липополисахарид менингококка связан с анатоксином столбняка. Среди B-клеток, которые узнают эту сложную молекулу, есть и такие, которые узнают именно липополисахаридную часть. Но поглощают они ее целиком, и им есть что предъявить T-лимфоцитам на MHC II — фрагменты анатоксина столбняка. Таким образом, удалось сформировать долговременную память к небелковым молекулам патогенных бактерий.

С вирусными заболеваниями ситуация совсем другая. Вирусы эксплуатируют наши клетки, поэтому задача создать лекарство, одновременно не слишком токсичное для нас и успешно останавливающее размножение вируса — очень сложная. К сожалению, создание вакцин от вирусов и других внутриклеточных возбудителей инфекции, таких как бактерии, вызывающие туберкулез, или малярийный плазмодий, — это тоже непростая задача, поскольку для эффективной защиты может быть необходимо вовлечь CD8+ цитотоксические клетки, которые способны распознавать фрагменты чужеродных белков на MHC I и точечно уничтожать поврежденные клетки своего организма. И хотя вакцины на основе очищенных белков определенно стоят проверки (а вдруг формирования антител будет достаточно, чтобы снизить риски до приемлемых значений?), все-таки лучше всего работают живые вакцины. Давайте рассмотрим несколько примеров современных живых вакцин против внутриклеточных паразитов — генная инженерия позволяет их оптимизировать.

Разработка вакцины от ротавируса продолжалась около 30 лет. Сейчас для применения доступны две живые вакцины (см. Ротавирус на сайте ВОЗ). Они эффективны, уровень защиты оценивают как 85–98%. Особый плюс — форма вакцинации: она совпадает с естественным путем заражения, а это означает, что иммунитет формируется именно там, где он нужен: на слизистых оболочках. Вакцина Rotarix — аттенуированный человеческий ротавирус, а RotaTeq — смесь ротавирусов крупного рогатого скота, в которые генно-инженерным путем заменили некоторые гены на гены белков ротавируса человека (рис. 2).

Рис. 2. Rotarix — аттенуированный человеческий ротавирус. RotaTeq — пять штаммов  ротавируса крупного рогатого скота, в которые встроены гены человеческого ротавируса: четыре из них экспрессирует белок капсида человеческого ротавируса VP7 разных серотипов, пятый — VP4 (см. Виды ротавирусов). Рисунок из статьи J. Angel et al., 2007. Rotavirus vaccines: recent developments and future considerations

Еще один очень опасный внутриклеточный паразит — малярийный плазмодий. Год назад стартовала иммунизация в Гане, Кении и Малави первой одобренной вакциной RTS,S (рис. 3). Она обеспечивает частичную защиту детей от малярии. Эта вакцина создана на основе фрагмента одного из белков спорозоита (см. Sporozoite) малярийного плазмодия, соединенного с белком оболочки вируса гепатита B. Белки оболочки гепатита B способы самопроизвольно собираться в капсид. Таким образом, вакцина RTS,S — это частицы, имитирующие капсид вируса гепатита B (вирусоподобные частицы, см. Virus-like particle), с содержимым из фрагмента белка спорозоита малярийного плазмодия. Она стимулирует как антительный, так и цитотоксический ответ; предполагается, что она прежде всего должна защищать от проникновения плазмодия в печень. Вакцина лучше работает, если добавить адъювант AS01 — он состоит из липосом и двух стимуляторов иммунитета. Один из них — модифицированный липид A, компонент клеточной стенки грамотрицательных бактерий, который эффективно распознается иммунной системой и вызывает ее активацию. Второй — сапонин QS-21. Сапонины вызывают повреждение клеточных мембран.

Рис. 3. Вверху: схема белка малярийного плазмодия. который тот синтезирует на стадии спорозоита и, по-видимому, с его помощью внедряется в клетки печени (см. Circumsporozoite_protein и Sporozoite). Внизу: схема сконструированной на основе этого белка вакцины RTS,S. Она включает в себя 189 аминокислот самого белка — 18 повторов из центрального региона белка и С-терминальная часть белка за исключением региона II — последовательности, которая прикрепляется к гликозилфосфатидилинозитолу (GPI anchor sequence) и участвует в проникновении в клетку. Эта С-терминальная часть содержит три известных эпитопа, распознаваемых Т-клетками (то есть эти пептиды попадают в «нарезку» белка человеческой клеткой и демонстрируются на белках комплекса гистосовместимости I и II класса). Белок прикреплен к белку оболочки вируса гепатита B. Рисунок из статьи D. C. Kaslowa & S. Biernaux, 2015. RTS,S: Toward a first landmark on the Malaria Vaccine Technology Roadmap

Над вакциной от малярии работали больше 30 лет и продолжают работать до сих пор. RTS,S обеспечивает частичную защиту детей, но вообще-то она недостаточно эффективная. Перспективны вакцины на основе ослабленных плазмодиев, которые прекращают развитие на разных стадиях (главное — чтобы развитие прекращалось до стадии, когда паразит проникает в эритроциты). Фактически, это те же аттенуированные вакцины, одна категория которых аттенуирована старой доброй радиацией, вызывающей множественные повреждения ДНК и мутации, а другая аттенуирована прицельно: у них дезактивированы/вырезаны некоторые важные гены, и таким образом точно известно, когда эти паразиты перестанут развиваться в организме.

Как еще можно подойти к задаче ослабить возбудителя заболевания? Можно «переписать» его геном. Компания Codagenix работает над таким «перепрограммированием вирусов». В геном вируса вносят сотни синонимичных мутаций. Вы знаете, что генетический код вырожденный (избыточный): одна и та же аминокислота кодируется несколькими триплетами нуклеотидов (несколькими кодонами), и, следовательно, часть мутаций не будет приводить к замене аминокислоты (это и есть синонимичные мутации). Однако не все триплеты, кодирующие одну аминокислоту, одинаково эффективно используются клеткой — и различия тут видоспецифичны. Поэтому можно заменить кодон на синонимичный, но неоптимальный — и получить вирус, чрезвычайно плохо размножающийся в человеческих клетках, но предоставляющий абсолютно те же антигены для B- и T-клеток, что и естественный вирус. К сожалению,  разработка продвигается медленно, и на первой фазе клинических испытаний находится только вакцина от гриппа (рис. 4).

Рис. 4. Стадии разработки вакцин компанией Codagenix. Изображение с сайта codagenix.com

Посмотреть схему платформы для создания таких вакцин можно здесь.

В решении задачи упомянуты рекомбинантные вакцины от вирусов: в живой безопасный вирусный вектор встраивают гены возбудителя заболевания. При этом вирусный вектор иногда способен реплицироваться в клетках после вакцинации, а иногда — неспособен. Несколько вакцин против Sars-CoV-19 на основе нереплицирующегося вирусного вектора уже находятся на фазе клинических испытаний (из них вакцина, разрабатываемая Оксфордом совместно с компанией АстраЗенека — уже на третьей, заключительной фазе). Российская вакцина, разрабатываемая в Институте Гамалеи, тоже относится к этому типу вакцин. Это логичный выбор. Такая вакцина формирует и антительный ответ, и T-клеточный ответ. Возможно, не настолько эффективный, как этого хотелось бы, поскольку, помимо антигенов возбудителя заболевания, в организм попадают еще антигены вирусного вектора — что если иммунный ответ разовьется прежде всего к ним? Вопрос требует дальнейших исследований.

Вакцины на основе белков или белковых субъединиц вируса не всегда несут достаточно информации о типе угрозы и не всегда вызывают достаточно сильный иммунный ответ. Поэтому для них широко используют адъюванты. Один из адъювантов нового поколения — CpG 1018 — представляет собой неметилированную короткую цепочку ДНК, которая связывается с толл-подобным рецептором 9 и активирует врожденный иммунитет. Врожденный иммунитет, в свою очередь, будет влиять на развитие приобретенного иммунитета.

И наконец, немного о ДНК- и РНК-вакцинах (рис. 5). Вакцины новейших поколений — ДНК- и РНК- — хороши тем, что их производство дешево, а сами они достаточно безопасны. Они работают именно изнутри клетки — то, что нам нужно в случае вирусов! Фрагменты синтезируемых белков будут выставлены на MHC I, а сам белок можно встроить в мембрану или отправить в межклеточное пространство — это значит, что в формирование защиты включатся и В-лимфоциты, и CD8+ T лимфоциты. И РНК, и ДНК вакцины могут стимулировать врожденный иммунитет через толл-подобные рецепторы, это дополнительный плюс. Одна из перспективных вакцин от Sars-CoV-19, которую разрабатывает компания «Модерна», — это вакцина на основе мРНК спайк-белка вируса. Она упакована в липосомы — маленькие липидные пузырьки, — которые доставят мРНК прямо в клетки, где на ее основе некоторое время будет синтезироваться спайк-белок.

Рис. 5. Сравнение ДНК- и РНК-вакцин. Для того чтобы доставить ДНК-плазмиду в клетки, нужны специальные условия, например воздействие электрического тока. РНК-вакцины можно доставить через липосомы — пузырьки из липидов, которые сольются с мембраной. Изображение из статьи E. Callaway, 2020. The race for coronavirus vaccines: a graphical guide

Однако иммунный ответ, который они вызывают, достаточно слабый, и поэтому уже сейчас понятно, что необходимо двух-трехкратное введение таких вакцин. РНК-вакцины должны быть более безопасны, чем ДНК-, так как они не встроятся в геном клетки; мРНК, кодирующая антиген вируса, через некоторое время деградирует и бесследно исчезнет из организма. ДНК вакцины более удобны в производстве и хранении просто потому, что ДНК более стабильна.

Рис. 6. Если мРНК еще и способна размножаться в клетке (это достигается вставкой мРНК РНК-зависимой РНК-полимеразы), то вакцина, скорее всего, будет более эффективна. Изображение из статьи A. B. Vogel et al., 2018. Self-Amplifying RNA Vaccines Give Equivalent Protection against Influenza to mRNA Vaccines but at Much Lower Doses

Сейчас в гонке за эффективной вакциной против SarsCoV-19 участвует больше тридцати ДНК- или РНК-вакцин, и, скорее всего, если эти вакцины в принципе способны обеспечить защиту от вируса, то в обозримом будущем какие-то из них выйдут на рынок.