Огоньки под ногами

Елена Клещенко
«Химия и жизнь» №9, 2014

Сразу две статьи этого номера «Химии и жизни» рассказывают о свечении биообъектов. На фото слева — малощетинковый червь Fridericia heliota, открытый учеными из Красноярского университета. О том, как был исследован его люциферин — вещество, которое при окислении ферментом люциферазой испускает голубоватый свет, — читайте в статье «Огоньки под ногами». На фото справа — синтетический люциферин фридериции в присутствии АТФ и других необходимых компонентов демонстрирует такое же свечение, как и белковый экстракт червя. Это подтверждает, что структура люциферина установлена верно.

В статье «Флуоресцентные репортеры и их репортажи» рассказывается о возможностях, которые предоставляет ученым флуоресценция, свечение вещества, индуцированное светом с меньшей длиной волны. Биомолекулы, несущие флуоресцентные метки-репортеры, — это не только информативно, но и красиво. Лучшее тому подтверждение  — микрофотографии с галереи ежегодного конкурса Nikon Small World: а — фибробласты мыши, б — веслоногий рачок Temora longicornis; в — митоз в клетках легких тритона; г — клетки глии мозжечка мыши in vivo (двухфотонная флуоресцентная микроскопия).

Пример «неживой» флуоресценции — коллоидные растворы квантовых точек разного размера. Квантовые точки — полупроводниковые кристаллы нанометровых размеров. Электроны в них могут совершать квантованные энергетические переходы, причем энергия переходов (а значит, и длина волны флуоресценции, или ее цвет) зависит от размера кристалла.

Напомним основные термины. Люминесценция — все виды излучения, вызванные возбуждением молекул. В частности, флуоресценция — свечение, возникающее после того, как вещество поглощает другое излучение. Всем известный пример флуоресценции в биосистемах — зеленый флуоресцентный белок GFP, найденный у медузы Aequorea victoria и ставший родоначальником семейства флуоресцентных белков, которые широко применяются в фундаментальной и прикладной науке. За открытие и разработку методов использования этих белков получили Нобелевскую премию по химии 2008 года Осаму Шимомура, Мартин Челфи и Роджер Тсиен.

Хемилюминесценция возникает в химических реакциях; применительно к биообъектам именно ее часто называют биолюминесценцией, опуская «хеми». Живые организмы никогда не оставляют химические реакции на произвол случая — практически каждая катализируется специально для этого приспособленным ферментом. Биолюминесценция не исключение: фермент люцифераза окисляет низкомолекулярное вещество люциферин, тот превращается в оксилюциферин, в итоге выделяется энергия — квант света. Биолюминесценция много раз возникала на разных ветвях эволюционного древа, поэтому люциферины — это группа разнообразных веществ с общей функцией; у разных животных — различные люциферины и, конечно, разные люциферазы. Классический пример люциферин-люциферазной реакции — огонек светлячка. У некоторых организмов осуществляется другой вариант: люциферин присоединяется к так называемому фотобелку и уже на нем окисляется при добавлении ионов металла (чаще всего кальция). Более сложный случай — перенос энергии с белка на белок с изменением спектра излучения. Так, свечение зеленого флуоресцентного белка медузы Aequorea victoria возбуждается синим светом другого белка — экворина. Он стал первым изучаемым фотобелком; его открытие в 1961 году было заслугой Осаму Шимомуры. Люциферин экворина называется «целентеразин», причем экворея не синтезирует его сама, а получает с пищей, поедая мелких членистоногих. Еще известна биолюминесценция грибов — светятся даже всем известные опята и валуи! — но она протекает по иному механизму и пока мало изучена.

Два года назад мы писали о мегагранте, который получили красноярский Институт фундаментальной биологии и биотехнологии (ИФБиБТ) Сибирского федерального университета и Осаму Шимомура (см. «Химию и жизнь», 2012, №7). Среди основных задач проекта были изучение молекулярно-клеточной организации биолюминесцентных систем высших грибов, кольчатых почвенных червей и других групп организмов, а также создание аналитических систем, использующих явление биолюминесценции, для медицины и мониторинга окружающей среды. В проекте участвовали сотрудники красноярских Института биофизики СО РАН и Института физики им. Л. В. Киренского СО РАН, московского Института биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова (подробности см. на сайте Биолюминесцентные биотехнологии).

Именно возможность изучать фундаментальные проблемы биолюминесценции заинтересовала Осаму Шимомура (нобелевского лауреата, уже весьма немолодого, журналисты постоянно спрашивали, как он решился на совместный проект, который требовал его длительного присутствия в России). «В 60-е годы эта область науки развивалась очень интенсивно, в 70-е — умеренно, а к настоящему времени практически сошла к нулю, — говорил он на пресс-конференции во время первого визита в Красноярск. — Очень тяжело получать результаты, это упорный труд, который занимает много времени. В Японии и Соединенных Штатах те, кто встречается с такими трудностями, как правило, находят более легкие пути. Я несколько раз предлагал проводить исследования грибов в Японии, и мне отказывали. Это очень интересная тема, но слишком сложная». Между тем без фундаментальных работ не будет и новых практических применений.

Светящихся животных в природе много. Из десятков видов «сухопутных» обладателей биолюминесцентной люциферин-люциферазной системы самые знаменитые — светляки, но гораздо больше светящихся организмов в морях и океанах. Это бактерии, губки, одноклеточные водоросли динофлагелляты, кишечнополостные — кораллы и медузы, моллюски, иглокожие, морские ракообразные (например, рачки рода ципридина, которых японцы называют «умихотару» — морской светляк; их светящиеся вещества выделил Осаму Шимомура еще до своего отъезда в США), многощетинковые черви... Помните, в «Человеке-амфибии» Александра Беляева: «Ихтиандр смотрит вверх — перед ним свод, сплошь усеянный мелкими, как пыль, звездами. Это ночесветки зажгли свои фонари и поднимаются на поверхность океана. Кое-где во тьме виднеются голубоватые и розоватые светящиеся туманности — плотные скопления мельчайших светящихся животных. Медленно проплывают шары, излучающие мягкий зеленоватый свет. Совсем недалеко от Ихтиандра светится медуза — она похожа на лампу, прикрытую затейливым абажуром с кружевами и длинной бахромой». Ночесветки — это как раз динофлагелляты Noctiluca scintillans, мельчайшие организмы, вызывающие свечение моря.

Люциферин-люциферазная система есть и у менее экзотических животных. Это земляные малощетинковые черви, представители того же класса, что и хорошо знакомый аквариумистам трубочник или дождевой червяк.

Один из участников мегагранта, Валентин Петушков, впервые увидел их еще студентом на биостанции Красноярского университета. Ночью в сырой земле рядом с палатками, в которых жили студенты, ярко светились какие-то точки. Источниками свечения оказались невзрачные беленькие червячки длиной один-два сантиметра. Гораздо позже, уже работая в лаборатории фотобиологии ИБФ СО РАН, Валентин вспомнил этот случай. Поиск по научной литературе ничего не прояснил, обнаружились лишь некоторые сведения о свечении крупных тропических червей. В конце 80-х В. Н. Петушков и Н.С. Родионова поехали на биостанцию, собрали там образцы почвы и нашли в них тех самых загадочных светящихся червей. Красноярские специалисты по систематике не смогли назвать их вид: в определителях этого червя не оказалось. Первое краткое описание было сделано при участии московского специалиста по беспозвоночным Н. Т. Залесской. Новый вид отнесли к уже известному роду Fridericia и дали ему красивое название heliota (от греческого helios — Солнце и otos — ухо; на уши похожи выросты их семяприемников). В ответ на механические, химические и электрические раздражители Fridericia heliota излучает голубоватый свет; свечение длится примерно десять минут, постепенно затухая. Светящиеся точки расположены на поверхности тела червя, целомическая жидкость, заполняющая тело изнутри, не светится (рис. 1).

Рис. 1. Червь Fridericia heliota и его люциферин

К тому времени были известны двенадцать видов тропических червей (из шести родов), светящихся в результате однотипной люциферин-люциферазной реакции. Хорошо была изучена мегасколецида Diplocardia longa — крупный (до 60 см!) червь, обитающий в песчаных почвах юга Джорджии (США). Люциферин D. longa — алифатический альдегид N-изовалерил-З-амино-1-пропаналь. Если добавить его к целомической жидкости других светящихся червей, начнется люминесценция — это значит, что их люциферазы способны окислять люциферин диплокардии. Однако в случае сибирских фридериций такая реакция не идет, следовательно, их биолюминесцентная система имеет иную природу.

В 2000-е годы Петушков и Родионова занялись этой темой вплотную. Проблема, с которой всегда сталкиваются специалисты по биолюминесценции, — получение достаточного количества биомассы для выделения и исследования веществ, участвующих в реакции. Характерно в этом смысле описание сбора материала на биостанции Фрайди Харбор, которое дал Шимомура в своей нобелевской лекции: «Мы начинали собирать медуз в шесть утра, а в восемь часть нашей группы принималась отрезать кольца (краевые участки зонтика медузы, наиболее ярко светящиеся. — Е.К.). Всю вторую половину дня мы проводили, экстрагируя экворин из колец. Потом мы снова собирали медуз с семи до девяти вечера, на завтра. Наша лаборатория выглядела как фабрика по переработке медуз, и пахло в ней медузами». В общем, первый шаг на пути к Нобелевской премии нельзя было назвать легким.

Непросто начиналось и исследование люциферина Fridericia heliota. Несколько лет подряд Петушков и Родионова ночами собирали червей в лесах, отмечали места их обитания, днем срезали почвенный покров, в мешках возили в институт и помещали в культиваторы, чтобы была возможность работать с червями и зимой. (Размножаться в лабораторных условиях сиятельные фридериции так и не захотели.) Позже из нескольких тонн почвы вручную выбирали червей (как мы помним, крошечных, не чета полуметровым американским). Ученые выделили люциферин и люциферазу, определили, что для их активности необходимы кислород, АТФ и ионы магния. Разработали методы очистки компонентов, получили УФ-спектр люциферина, исследовали влияние на реакцию in vitro рН и температуры, солей и детергентов.

Рис. 2. CompX — фрагмент люциферина Fridericia heliota; справа его неприродный изомер

Новые возможности для развития темы предоставил мегагрант. Создание специальной лаборатории, ориентированной на фундаментальные исследования биолюминесценции, позволило подступиться к установлению структуры нового люциферина. За три года удалось получить всего 90 г очищенной биомассы (а это более 50 000 червей!), выход люциферина составил 5 мкг. Для сравнения: в 1957 году Уильям Мак-Элрой (Университет Джонса Хопкинса, США) со студентами собрал большущую кучу светляков, из которых потом выделил 9 мг люциферина для определения его структуры. Люциферина фридериции оказалось почти в 2000 раз меньше — задача нетривиальная. Однако в экстракте червя, кроме люциферина, были обнаружены другие соединения с похожими спектральными и хроматографическими свойствами. Логично было предположить, что это или субстраты, из которых синтезируется люциферин, или продукты его деградации. В частности, довольно высоким было содержание вещества, получившего обозначение CompX, — около 150 мкг, в 30 раз больше люциферина. Максим Дубинный и Кирилл Надеждин в ИБХ провели ЯМР-спектроскопию и масс-спектроскопию этого вещества и предложили два варианта его структуры (рис. 2). Вероятно, это производное природной аминокислоты тирозина. Чтобы проверить, содержится ли в черве Z- или E-изомер, пришлось синтезировать оба и сравнить их спектральные характеристики. Идентичным природному образцу оказался Z-изомер, он обладал и флуоресценцией, в отличие от другого.

Конечно, спектры снимали и для самого люциферина, хотя возможности исследования были жестко ограничены малым количеством вещества. На этом этапе произошла страшная история, которую мне рассказал Максим Дубинный. Когда настало время растворить пять микрограммов люциферина и отнести на ЯМР для самого главного анализа, к нему подошел коллега с вопросом: «А это что?», схватил пустую на вид пробирку... и уронил. Стеклянная пробирка с результатом трех лет кропотливой работы упала на кафельный пол, подпрыгнула, но не разбилась. Вот так у ученых и появляются седые волосы.

Результаты ЯМР-спектроскопии показали, что в состав люциферина червя, помимо Z-изомера CompX, входят остатки лизина и гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК). Кроме того, стала известна брутто-формула люциферина: C₂₃H₂₉N₃O₁₁. Если вычесть из нее брутто-формулы лизина, ГАМК и CompX (с учетом двух молекул Н₂О, которые должны были освободиться при образовании связей между фрагментами) — C₂₃H₂₉N₃O₁₁ – (C₆H₁₄N₂O₂ + C₄H₉NO₂ + C₁₁H₁₀O₆ – 2H₂O), — то получим С₂О₃ — остаток щавелевой кислоты. Из-за небольшого количества люциферина удалось получить только часть спектров, необходимых для установления его структурной формулы, поэтому щавелевая кислота осталась «невидимой». Но главное — не было понятно, в каком порядке эти четыре остатка связаны между собой.

Если названные фрагменты соединены пептидными связями (карбоксильная группа одного фрагмента связана с аминной группой другого), с учетом того факта, что у CompX и оксалата нет аминогрупп, а у лизина их две, — получается десять вариантов. Теоретически можно было бы получить искусственно все возможные комбинации, однако на это уйдет слишком много времени. К счастью, методы ЯМР-спектроскопии позволяют узнать, какие именно карбоксильные группы в молекуле свободны, а какие участвуют в образовании пептидной связи. Для этого Максим Дубинный снял всего десять ЯМР-спектров при разных значениях рН (дело в том, что переход СООН-группы в СОО^– в нейтральной или щелочной среде влияет на соседние группы, и эти изменения можно наблюдать). Оказалось, что карбоксилы ГАМК и лизина свободны, тогда как оба карбоксила CompX участвуют в образовании связей. Таким образом, вариантов осталось всего четыре (рис. 3).

Рис.  3. Структуры четырех пептидных изомеров люциферина. Только соединение 1 испускало свет при смешении с люциферазой F. heliota

Четыре кандидата на роль люциферина были получены в ИБХ группой синтеза природных соединений под руководством Ильи Ямпольского. «Соединение 1 оказалось идентичным по всем спектральным характеристикам природному люциферину, и, что самое важное, оно вступило в реакцию биолюминесценции с люциферазой червя с испусканием света. «Момент истины» настал 14 октября 2013 года: в этот день были получены спектры ЯМР, идентичные спектрам природного люциферина, а спустя два часа зарегистрирован сигнал синтетического люциферина на люминометре в присутствии АТФ и белкового экстракта червя» (из пресс-релиза авторов работы на сайте ИБХ РАН). Уже не было никаких сомнений, что структура нового люциферина установлена. Этот результат был опубликован в Angewandte Chemie, одном из самых престижных химических журналов.

Теперь стоит задать вопрос: что дальше? Мегагрант завершен. В ходе исследования образовался уникальный коллектив ученых, способный решать задачи, на первый взгляд кажущиеся неразрешимыми. Осаму Шимомура так отозвался об успехе российских коллег: «Теперь, я уверен, в области химии биолюминесценции исследователи вашей группы имеют самые высокие в мире стандарты и возможности. Ваша группа будет лидировать в области биолюминесценции, и я надеюсь, что вы получите адекватную финансовую поддержку, чтобы внести свой вклад в мировую науку». Полученные результаты весьма впечатляют. Люциферин Fridericia heliota сравнительно несложного строения, более стойкий, чем люциферин светлячка, не токсичный, в отличие от бактериального люциферина. Все это сулит хорошие перспективы его практического использования. Но, к сожалению, авторам пока не удалось очистить до индивидуального состояния и получить искусственно второй важный компонент новой биолюминесцентной системы — люциферазу Fridericia heliota, без которой «включить» люциферин невозможно, нельзя и независимо подтвердить результаты в другой лаборатории, а также применить их на практике. А значит, научный поиск будет продолжаться.

Кому и зачем нужна люминесценция

После рассказа о научном результате всегда остается о чем поговорить с авторами открытия. Зачем живые организмы светятся, зачем ученые исследуют свечение, каковы дальнейшие перспективы... На вопросы «Химии и жизни» ответили соавторы статьи в “Angewandte Chemie”, посвященной люциферину F. heliota.

 

Кандидат биологических наук Н. С. Родионова, научный сотрудник лаборатории фотобиологии ИБФ СО РАН	Кандидат физико-математических наук М. А. Дубинный, научный сотрудник лаборатории биомолекулярной ЯМР-спектроскопии ИБХ РАН
Кандидат биологических наук В. Н. Петушков, старший научный сотрудник лаборатории фотобиологии ИБФ СО РАН	Кандидат химических наук И. В. Ямпольский, руководитель группы синтеза природных соединений, научный сотрудник лаборатория биофотоники ИБХ РАН

 

— После вручения нобелевской премии 2008 года за флуоресцентные белки много говорили об их преимуществах перед люциферин-люциферазной системой. Есть ли преимущества у люциферин-люциферазной системы перед флуоресцентными белками?

М.Д. В живых организмах очень много флуоресцирующих компонентов, поэтому найти целевую флуоресценцию сложнее, чем свечение люциферина. Если же мы не подсвечиваем образец ультрафиолетом, но регистрируем свечение, это точно то, что нужно, — обычно живые организмы не светятся. Это означает чувствительность во много раз большую, чем у обычной флуоресценции.

И.Я. Иначе говоря, при регистрации флуоресценции всегда есть соотношение сигнал/шум, а у люминесценции шума почти нет. Преимущество по чувствительности — это первое, а второе — именно люминесценцию используют при высокопроизводительном скрининге (high throughput assay), например при поиске потенциальных лекарственных препаратов среди веществ-кандидатов, когда огромные роботы проводят много тысяч реакций одновременно.

— То есть флуоресцентный белок удобнее внедрять в биологические системы, а люциферин-люциферазную систему использовать для тестов in vitro, тестов и для медицины и экологии?

М.Д. В общем, да.

И.Я. Одно из применений люминесценции — измерение концентрации АТФ.

— Потому что люцифераза нуждается в АТФ для проведения реакции?

И.Я. Люцифераза светляка — да. Она была единственной АТФ-зависимой из семи ранее известных, наша оказалось второй. Можно взять десять тысяч образцов, добавить к ним люциферин-люциферазу и проверить концентрацию АТФ сразу во всех. На самом деле спектры приложений люциферин-люциферазной системы и флуоресцентных белков пересекаются, но не совпадают.

— Осаму Шимомура часто рассказывает, как люминесценцию используют в качестве датчика кальция...

И.Я. Сначала надо было открыть систему, нуждающуюся в кальции. Из тех, которые хорошо изучены, это пока только экворин. Или похожие на него белки, как обелин.

— Значит, каждая новая люциферин-люциферазная система — это потенциально новые применения?

И.Я. В принципе да. Но зато в чем преимущество флуоресценции перед люминесценцией: она более наглядна, с ее помощью можно разглядывать микроскопические структуры вплоть до одной молекулы и с помощью этого достигать очень высокого разрешения в микроскопии. С люминесценцией такое невозможно, к сожалению.

— А чисто физические методы, такие как квантовые точки — конкуренты биологическим?

И.Я. С квантовыми точками проблема в том, чтобы селективно их доставить куда-либо. С флуоресцентным белком можно задействовать генно-инженерные и молекулярно-биологические подходы, чтобы локализовать его или в ядре, или в мембране. С квантовыми точками такой селективности до сих пор не достигнуто. Пытаются ее достичь, например привешивают к ним какие-то сигналы локализации — партнеры по связыванию, антитела. Но пока шум там огромный. В общем, у каждого метода своя область применения и свои ограничения.

— Детский вопрос: какие есть гипотезы по поводу того, зачем животные светятся?

И.Я. Пока мы этого не знаем. Месяц назад я был в Швеции на конгрессе, посвященном люминесценции. Там кроме химиков были и биологи, которые пытаются ответить на этот вопрос. Я узнал для себя много нового, в частности что у биолюминесценции есть около 15 различных преимуществ.

— Аналог предупреждающей окраски, привлечение партнера...

И.Я. Да, и отпугивание хищника. Но то, что мне понравилось и чего я не знал до этого, — оказывается, медуза начинает светиться, когда ее атакует рыбка. Медузы небольшие, и рыбы их едят не очень крупные, но большие рыбы, видя этот сигнал, приплывают и съедают хищника, который пытался съесть медузу. Эдит Уиддер из «Ocean Research & Conservation Association» (США) с коллегами сняла фильм для канала «Дискавери». Им удалось впервые заснять на видео гигантского кальмара. Для этого они опустили в океан светильник, похожий на медузу, с огоньками по кругу, и пришли в полный восторг, когда на него кинулся кальмар — огромный, с двухэтажный дом. Он думал, что это медуза светилась в ответ на атаку рыбы, и даже, насколько можно приписывать кальмару человеческие реакции, казался очень недовольным, что никакой рыбы не было.

— А по поводу светящихся червей есть предположения, зачем им это нужно?

И.Я. В том числе и на этом конгрессе я спрашивал у биологов, но никто не смог мне этого сказать, даже специалисты.

— При том, что светящихся червей известно довольно много?

М.Д. В наших лесах их два вида. Второй — из рода Henlea, про них мы еще не знаем, как они светятся.

— Так есть еще и второй?!

В.П. Действительно, в тех же образцах почвы, которые мы в 89–90 годах собирали на биостанции, обнаружился и другой вид энхитреид (семейство малощетинковых червей, к которому принадлежат фридериции. — Примеч. ред.). Мы этого никак не ожидали, найти один-то светящийся вид было удачей, о двух даже мысли не было. Выбирали червей в темноте, промывали, рассматривали их внутренние органы под микроскопом, считали щетинки. Все сильно варьировало, но мы это списывали на наличие несветящихся червей, которые неизбежно попадаются в пробах. Мелких светящихся червей считали молодыми, тех, что покрупнее и потолще, — взрослыми. Чтобы все рассортировать, мы начали проверять червей в биолюминометре, помещая их по одному в кювету с водой, а потом смотрели под микроскопом. Но все еще больше запуталось. Наконец мы заметили, что после крупных червей светится сама вода в кювете, то есть что-то светящееся выделяется из них во внешнюю среду. А вот после тонких мелких светящихся червей вода не светится. В итоге у нас получились три группы: сорные несветящиеся, мелкие тонкие светящиеся и более крупные толстенькие светящиеся черви, которые вдобавок еще и выделяют светящуюся слизь. И по количеству щетинок, и по виду внутренних органов светящиеся черви оказались разными. Два вида! Это было потрясающе.

Н.Р. Позже мы сделали первые снимки. Валентин придумал оригинальный способ — червя просто прижимали пальцем через целлофан к фотопленке в темноте на определенное время, потом проявляли. На снимках тоже отчетливо было видно: тонкие черви, получившие позже имя Fridericia heliota, имели светящиеся точки на теле, а толстые, отнесенные нами к роду Henlea, выпускали светящееся облако слизи.

— У Henlea тоже люциферин-люциферазная система?

Н.Р. Да, но биолюминесцентные системы у них разные. Кроме люциферина, люциферазы и кислорода для биолюминесценции Henlea нужен кальций (в случае Fridericia heliota — АТФ и магний). Точный вид светящейся хенлеи еще не установлен. Есть три вида этого рода, наиболее близких к нашей по описанию, но ни с одним нет полного совпадения. Биолюминесценция не отмечена ни у одного из них, ведь «нормальные» ученые делали их описание при свете дня.

В.П. В лесах Красноярского края хенлеи попадаются редко: в удачных местах примерно одна к ста фридерициям. Но в одной старой статье, 1929 года, мы встретили описание очень похожего червя — Henlea irkutensis, правда про свечение не было ни слова. Съездили в Иркутскую область и там действительно нашли наших хенлей, на которых потом сделали ряд экспериментов, сравнили две биолюминесцентные системы и опубликовали результаты в «Докладах Академии наук». Основная же работа велась по теме Fridericia heliota.

— Так вот, возвращаясь к биологической целесообразности...

М.Д. По поводу целесообразности: любая люминесцентная система сначала возникает, а потом находит применение.

И.Я. Это, как известно, одна из трудностей эволюционной теории, которые отмечал еще сам Дарвин, причем именно биолюминесценцию он и привел в качестве примера. Этот признак, казалось бы, не может появиться постепенно: свечение или есть, или его нет. Но если признак не проявлялся фенотипически, то как он мог сформироваться под воздействием отбора?

— Обычно на это отвечают, что на ранних стадиях формирования он был нужен для чего-то другого.

И.Я. Но в данном случае совсем не очевидно, для чего. Есть версии, например защита от активных форм кислорода, но для меня не слишком убедительные.

М.Д. Мне кажется, раньше для чего-то мог быть нужен продукт окисления. То, что червяки светятся на любое воздействие, при любой активности, подтверждает эту гипотезу: активируется метаболизм, включается свет. Но точного ответа мы не знаем.

— Максим, расскажите, как вы стали участником этой работы Кто обращается к вам в лабораторию ЯМР-спектроскопии с просьбой определить структуру?

М.Д. Основная работа нашей лаборатории — установление структуры белков, причем обычно мембранных — это самая сложная структурная работа. Мембранные белки нельзя просто растворить в воде, они плохо кристаллизуются, поэтому рентгеноструктурный анализ мало помогает. К белку приходится добавлять модель мембраны, размер комплекса становится больше, это для ЯМР хуже. Такие комплексы менее стабильны, все время норовят выпасть из раствора в осадок. Рекомбинантные белки получить тоже трудно, потому что они не растворяются в самой клетке. Но, несмотря на методические сложности, мы эту тему двигаем. А иногда нас просят определить структуру какого-нибудь маленького соединения.

Первый наш вопрос: а почему этим стоит заниматься, чем это полезно? Очень хорошо, когда приходят люди, которые нашли какое-то активное соединение — уже выделили его, очистили, показали его активность. Они не могут гарантировать, что это соединение еще не известно науке, потому что это мы должны сказать, известно оно или нет. Но они говорят: у нас вещество, которое светится, или блокирует болевые рецепторы, или делает еще что-то интересное. Понятно, что на это стоит потратить время.

— Будут ли новые исследования люминесцентных веществ?

В.П. Конечно. Теперь, когда у нас есть огромный опыт с Fridericia heliota и отличная команда, думаем, нам удастся разобраться и с биолюминесценцией хенлеи.

И.Я. Не будем забегать вперед, но мы уже сейчас занимаемся другими люминесцентными системами. В частности, есть люминесцентная система грибов, к которой люди уже сто лет пытаются подступиться. У нас уже имеются первые структурные данные, которые мы сейчас готовим к публикации.

— Даже не спрашиваю, зачем грибам нужна люминесценция...

И.Я. Этого никто пока не знает, убедительных экспериментов нет. Но поскольку грибы светятся не так ярко, как те же червяки, то, возможно, здесь как раз это побочный эффект какой-то другой реакции. Тем более что у грибов люминесценция не такая, как у медуз и червяков: у них можно зафиксировать все переходные состояния от полного нуля до довольно-таки яркого света.

— Как сейчас, после завершения мегагранта, обстоят дела с финансированием?

И.Я. На то, чтобы просто работать, есть деньги. Но денег много не бывает, мы боремся постоянно.

— Вы не пробовали подавать на грант российского научного фонда?

И.Я. Я подавал именно на эту тему и получил отказ. Отзыв одного эксперта был положительный, а другой рассудил достаточно оригинально: у авторов отличные публикации, значит там уже все сделано, зачем им еще давать денег?

В.П. Мы сейчас попытаемся получить грант РФФИ. Посмотрим, удастся ли.

Беседовала Е. Клещенко

Литература:
Valentin N. Petushkov, Maxim A. Dubinnyi, Aleksandra S. Tsarkova, Natalja S. Rodionova, Mikhail S. Baranov, Vadim S. Kublitski, Osamu Shimomura, and Ilia V. Yampolsky. A Novel Type of Luciferin from the Siberian Luminous Earthworm Fridericia heliota: Structure Elucidation by Spectral Studies and Total Synthesis. Angewandte Chemie International Edilion, 2014, 53, 22, 5566–5568, doi:10.1002/ange.201400529.