Многокомпонентный вирус комара

Цветные пятна на этом изображении — клетки культуры С6/36, зараженные вирусом Guaico Culex. Культура С6/36 ведет начало от клеток личинки азиатского тигрового комара (Aedes albopictus). Вирус Guaico Culex был выделен из комаров рода Culex близ общины Гуайко (Guaico) на острове Тринидад, о чем сообщает его название. Этот вирус многокомпонентный: его геном разделен на пять сегментов, каждый из которых пакуется в отдельный вирион. Эти сегменты можно избирательно окрасить c помощью флуоресцентных меток и получить такую картинку. Белые овалы на ней — это ядра клеток, а их цветное окружение — цитоплазма, заполненная вирусной РНК. Guaico Culex — первый известный многокомпонентный вирус животных.

У многих вирусов геном представлен одной молекулой ДНК или РНК. Есть и вирусы с сегментированным геномом, который разделен на несколько молекул, объединенных одной оболочкой (например, вирус гриппа А). А есть многокомпонентные вирусы, у которых каждый сегмент генома упакован в отдельный вирион. Для успешной инфекции все (или почти все) сегменты должны оказаться в одной клетке. Точнее, белки, закодированные в сегментах. Поэтому таким вирусам проще распространяться между плотно контактирующими клетками: если в одну клетку не попали какие-то сегменты генома, вирусы из соседних клеток могут «поделиться» недостающими белками. Возможно, именно поэтому подавляющее большинство многокомпонентных вирусов специализируются на растениях и грибах, хотя доказанной причины такой избирательности нет. При этом они переносятся членистоногими, и некоторые способны размножаться и в таком животном-переносчике.

Но Guaico Culex был выделен из комаров рода Culex, самки которых питаются кровью, а не растениями. Этот вирус принадлежит группе джингменвирусов (см. Jingmenvirus) из семейства Flaviviridae (см. статью Флавивирусы: новые, старые и будущие угрозы). Представители этой группы заражают разнообразных членистоногих. Некоторые джингменвирусы уже были обнаружены наряду с членистоногими и в млекопитающих, в том числе человеке. То есть их можно отнести к арбовирусам — группе, объединяющей вирусы, способные заражать и членистоногих, и позвоночных. Геном джингменвирусов сегментирован, однако в многокомпонентности они ранее не были замечены.

Положение Guaico Culex (GCXV) на филогенетическом дереве флавивирусов, построенном по белку NS5. Длины ветвей соответствуют числу аминокислотных замен. Числа со стрелками показывают степень надежности топологии, измеренную двумя способами, где 100 — самая высокая надежность. Иллюстрация показывает, что джингменвирусы образуют надежную единую кладу. Рисунок из статьи J. T. Ladner et al., 2016. A multicomponent animal virus isolated from mosquitoes

На многокомпонентность Guaico Culex указала скорость падения числа инфекций при снижении концентрации вируса в среде. Эту скорость можно определить с помощью так называемого «анализа бляшек» (см. The plaque assay). Для этого берется так называемая адгезивная клеточная культура, представляющая собой монослой клеток на твердой среде в чашке Петри, в которую добавляется содержащий вирус раствор. Культуру называют адгезивной, так как ее клетки прикрепляются к твердой среде или друг к другу. Вирусы заражают некоторые клетки монослоя, и какое-то время инфекция распространяется на соседние клетки, после чего культуру фиксируют и красят. В итоге места, где есть живые клетки, окрашиваются, а зоны, где распространялся вирус, — нет. Так и получаются «бляшки»: на самом деле это просто неокрашенные пятна, свободные от клеток. Очевидно, что чем ниже концентрация вируса в добавляемом растворе, тем меньше бляшек образуется. При этом чем больше вирионов должны одновременно заразить одну и ту же клетку для успешной инфекции, тем быстрее будет снижаться число бляшек при разбавлении вирусного раствора. Для Guaico Culex оценка составила 3–5 вирионов.

«Анализ бляшек» для определения скорости снижения числа инфекций при понижении содержания вирусов в растворе. На культуру клеток в чашке Петри капают раствор, содержащий вирусы. Каждая вирусная частица заражает одну клетку, убивает ее, затем инфекция распространяется на соседние, и в итоге образуется «бляшка» — место, свободное от живых клеток. Концентрация вируса повышается от фото a к c. При очень большой концентрации очаги инфекций сливаются (с). Фото с сайта oetltd.com

Геном вируса расшифровали короткими участками — «прочтениями», которые in silico «собрали», как мозаику, используя перекрывающиеся «прочтения» (см. Картирование коротких прочтений). В одну молекулу весь геном не собрался: получилось собрать только отдельные куски, между которыми не было перекрывающихся участков. Для некоторых образцов получилось пять таких кусков, для некоторых — четыре. Подтвердить, что геном разделен на сегменты, удалось с помощью электрофореза окрашенных нуклеиновых кислот в агарозном геле: более короткие молекулы быстрее движутся по гелю под действием электрического поля, и в итоге гель становится полосатым. Каждая полоска представляет собой скопление сегментов одной длины. Оказалось, что геном Guaico Culex представлен пятью сегментами РНК. При этом пятый сегмент не обнаружился в трети образцов вируса, что наводит на мысль о его опциональности.

Сегменты генома разной длины, разделенные методом электрофореза. Слева — специальный набор маркеров для определения молекулярной длины. В англоязычном мире он называется ladder — «лестница». Длины двух сегментов (2 и 3) сопоставимы, и разделить их с помощью такого метода нельзя. Фото из статьи J. T. Ladner et al., 2016. A multicomponent animal virus isolated from mosquitoes

В экспериментах вирус заражал клетки комаров, но не справлялся с клетками клещей, мух и позвоночных. После обработки раствором, разрушающим мембраны, Guaico Culex терял способность заражать клетки. Это указывает на то, что вирус покрыт липидной оболочкой. Сами комары вирусом тоже заражались, инфекцию переносили стойко, и найти следы вируса в личинках изначально не удалось. Однако более позднее исследование показало, что до 35% яиц зараженных комаров содержат вирус — то есть он способен передаваться по наследству.

Самка комара Culex quinquefasciatus с яйцами. Именно для этого вида показана «вертикальная» передача вируса Guaico Culex. Фото © Sean McCann с сайта flickr.com, Флорида, США, 8 октября 2006 года

Чтобы понять, какие белки закодированы в сегментах вируса, ученые сначала нашли в этих сегментах потенциальные гены. Для синтеза белка на матрице РНК важно, чтобы в гене были так называемые старт-кодон и стоп-кодон, которые показывают синтезирующим белок рибосомам, где начать и где закончить читать ген. Получается, что если в геноме находятся старт-кодон и стоп-кодон, разделенные вменяемым числом нуклеотидов, кратным трем (кодон — это тринуклеотид, кодирующий одну аминокислоту), можно заподозрить, что это белок-кодирующий ген. А если это ген, то можно легко прочитать, какую аминокислотную последовательность он кодирует.

Для таких потенциальных белков поискали похожие по последовательности аминокислот белки среди известных вирусов. В первых двух сегментах нашлось по одному гену, и белки, которые они кодируют, очень напоминают важные ферменты вирусов рода Orthoflavivirus — близких родственников Guaico Culex с несегментированным геномом. Известные представители этого рода — вирус денге (см. Dengue virus), вирус Зика (см. картинку дня Вирус Зика) и вирус клещевого энцефалита (см. статью Клещевой энцефалит: характер нордический, к людям беспощаден).

Сегменты 3 и 4 кодируют по три белка, непохожих на белки других вирусов. Но понять их функции помог протеогеномный анализ: выделенные вирионы расщепили на белки, а белки — на пептиды. С помощью масс-спектрометрии восстановили аминокислотный состав пептидов и определили, каким белкам вируса, восстановленным по геному, они принадлежат. Белки, найденные таким способом, — структурные, они входят в состав вириона. Пять из шести белков, закодированных в третьем и четвертом сегменте, оказались структурными. Функция оставшегося белка пока остается тайной, как и белка, закодированного в пятом сегменте. О них можно сказать только, что они неструктурные, так как не нашлись в протеогеномном анализе.

Схематичное изображение генома Guaico Culex с предсказанными генами (гены подписаны названиями белков, которые они кодируют). Красным цветом обозначены предположительные трансмембранные участки, синим — так называемые «сигнальные пептиды» — короткие концевые участки, характерные для секретируемых и трансмембранных белков. Рисунок из статьи J. T. Ladner et al., 2016. A multicomponent animal virus isolated from mosquitoes

Главная интрига Guaico Culex — спектр его хозяев. В принципе, для существования в комариной популяции вирусу не обязательно заражать теплокровных, которыми питаются комары: последние могут передавать вирус половому партнеру или потомству. К тому же в экспериментах устойчивость к Guaico Culex показали не только три разные культуры клеток позвоночных, но и новорожденные мышата — очень нежные объекты, которые обычно легко заражаются арбовирусами, то есть вирусами, переносчиками которых являются членистоногие. С другой стороны, Jingmen tick virus, относительно близкий родственник Guaico Culex, уже был уличен в заражении людей. Поэтому об эпидемиологических особенностях Guaico Culex нам пока остается только догадываться.

Фото © Michael Lindquist с сайта sci.news.

Галина Клинк