Капсид ВИЧ

На рисунке изображены два варианта структуры капсида вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), определенные экспериментально с помощью комбинации различных методов: рентгеноструктурного анализа, электронной микроскопии, криоэлектронной томографии и компьютерного моделирования. Капсид — это белковый «контейнер», внутри которого находится геном вируса. Капсид ВИЧ имеет длину около 90 нм и ширину около 50 нм и состоит из множества (более тысячи) одинаковых молекул белка, известного как белок CA или p24.

Cначала молекулы белка СA собираются в группы по шесть штук и образуют гексамеры — симметричные шестиугольные структуры. Затем гексамеры стыкуются друг с другом подобно шестиугольной плитке. Также молекулы белка СА могут собираться по пять штук в пентамеры — симметричные пятиугольники. Эти пятиугольники (выделенные на рисунке фиолетовым цветом) стыкуются с шестиугольниками (голубого цвета), создавая фрагменты с меньшим радиусом кривизны и позволяя капсиду «закруглиться» и замкнуться. Поэтому структуры капсида ВИЧ часто сравнивают со структурой фуллеренов — углеродных наночастиц в форме замкнутых многогранников, которые также состоят из пяти- и шестиугольных граней.

Вариант капсида, изображенный справа, состоит из 186 гексамеров и 12 пентамеров. Вариант, изображенный слева, включает 216 гексамеров и 12 пентамеров — это самая большая биомолекулярная структура, когда-либо определенная экспериментально и загруженная в базу данных Protein Data Bank: он имеет молекулярную массу 34 853 кДа (35 миллионов единиц молекулярной массы!) и состоит из 1356 (216*6 + 12*5 = 1356) одинаковых белковых цепей.

Вирус иммунодефицита человека вряд ли нуждается в особом представлении. В настоящий момент 38 миллионов человек по всему миру живет с ВИЧ; в 2019 году было зарегистрировано 1,7 миллиона новых случаев инфицирования, и 690 тысяч человек умерли от причин, связанных с ВИЧ-инфекцией. Несмотря на то что современная антиретровирусная терапия помогает избежать осложнений, позволяет пациенту дожить до старости и делает инфицированного человека незаразным для окружающих, инфекция ВИЧ продолжает оставаться одной из крупнейших проблем здравоохранения. Все существующие препараты против ВИЧ различными способами подавляют размножение вируса, но никак не могут повлиять на те клетки, в чью ДНК вирусный геном уже встроился. Поэтому, если прекратить принимать лекарства, вирус «воскресает» и снова начинает разрушать иммунную систему.

Вирус иммунодефицита человека относится к подтипу оболочечных вирусов, то есть его капсид заключен в дополнительную липидную оболочку, состоящую из фрагментов мембраны клетки-хозяина (см. Вирусная оболочка). Таким образом вирус прячется от иммунной системы: благодаря наличию оболочки поверхность вируса становится похожа на поверхность обычной клетки. Главный же недостаток липидной оболочки состоит в том, что она гораздо более чувствительна к изменениям внешней среды, чем жесткий белковый капсид безоболочечных вирусов, поэтому оболочечные вирусы (в том числе и ВИЧ) гораздо быстрее разрушаются при высыхании, перепаде температур и воздействии дезинфицирующих средств.

Жизненный цикл вируса хорошо показан в анимированном видео:

На нем видно, как при инфицировании новой клетки липидная оболочка вируса сливается с мембраной клетки-хозяина, высвобождая во внутриклеточное пространство содержащийся внутри нее капсид с геномом. Капсид ВИЧ не только защищает заключенный в нем генетический материал и вирусные белки, но и взаимодействует с некоторыми белками клетки-хозяина, обеспечивая перемещение вирусных частиц внутри клетки вдоль микротрубочек и их транспортировку внутрь клеточного ядра, где вирусный геном встраивается в геном клетки-хозяина.

A — строение вириона ВИЧ. Геном, представляющий собой две копии одноцепочечной РНК, заключен внутрь капсида, а капсид, в свою очередь, заключен в липидную оболочку (также называемую суперкапсид). На оболочке находятся гликопротеиновые шипы, необходимые для распознавания клетки-хозяина и проникновения вируса внутрь клетки. Внутри капсида, помимо геномной РНК, находятся также белки, необходимые для жизнедеятельности вируса, в частности обратная транскриптаза, синтезирующая ДНК на основе вирусной РНК, и интеграза, встраивающая получившуюся ДНК в геном клетки-хозяина. Более подробно рассмотреть структуру вириона и узнать про функции его компонентов можно в замечательной интерактивной модели RCSB Protein Data Bank. Рисунок с сайта en.wikipedia.org. B — фотография вирионов ВИЧ, сделанная с помощью трансмиссионного электронного микроскопа. Вирионы заключены в сферическую оболочку, внутри которой видны капсиды конической формы. Фото © Maureen Metcalfe, Tom Hodge с сайта phil.cdc.gov

Вирусы сильно отличаются друг от друга по размеру (от 10 до 500 нм), форме и наличию дополнительной внешней оболочки. Капсиды вирусов бывают разной формы, но чаще всего встречается икосаэдрическая (в виде симметричного многогранника) как, например, у аденовирусов и герпесвирусов, и спиралевидная, как у вируса Эбола или коронавируса SARS-CoV, где множество одинаковых белковых молекул укладывается по спирали и образует длинную трубку вокруг цепи ДНК или РНК. У большинства вирусов, включая ВИЧ, капсид образован одним-единственным белком, что экономит место в вирусном геноме.

Схематичное изображение структур и сравнительных размеров вирусов, вызывающих заболевания человека. Зеленым цветом обозначен капсид, светло-голубым — оболочка (суперкапсид), сформированная из липидной мембраны клетки-хозяина, желтым — гликопротеиновые шипы, коричневым — белки матрикса (см. Viral matrix protein). Верхний ряд слева направо: вирус натуральной оспы, вирус герпеса, вирус бешенства, кори, ВИЧ-1, SARS-CoV. Нижний ряд слева направо: вирус Эбола, папилломавирус; вирус, вызывающий лихорадку Денге, и вирус Зика, вирусы гепатитов C, B и A, парвовирус. Рисунок с сайта Viral Zone SIB Swiss Institute of Bioinformatics viralzone.expasy.org

Первым этапом в изучении структуры капсида ВИЧ было решение структуры отдельной молекулы белка CA. Рекомбинантный белок нарастили в бактериальных клетках, очистили, получили его кристаллы и определили его структуру методом рентгеноструктурного анализа. Оказалось, что он состоит из двух доменов, N-концевого и С-концевого, соединенных между собой гибким линкером. Также методом рентгеноструктурного анализа была определена структура гексамеров и пентамеров. То, что один и тот же белок может образовывать и пентамеры, и гексамеры, объясняется гибкостью его молекулы. Вообще, такая ситуация, когда большой и не идеально симметричный капсид состоит всего лишь из одного вида белка, часто встречается в мире вирусов и возможна как раз благодаря тому, что молекулы белка капсида достаточно гибкие и могут принимать разные конформации.

Чтобы детально изучить то, как гексамеры стыкуются между собой, исследователи разработали экспериментальный метод, когда очищенные гексамеры in vitro соединяются между собой и образуют трубчатые структуры (в отсутствие пентамеров структура не может замкнуться). Полученные трубки были исследованы методом электронной микроскопии, и их структура была определена с высоким разрешением. Для того чтобы определить структуру целого капсида, у зрелых вирусных частиц ВИЧ разрушили внешнюю оболочку и исследовали очищенные от оболочки капсиды методом криоэлектронной томографии, когда с помощью электронного микроскопа делаются снимки образца под разными углами и на их основе определяют трехмерную структуру (по такому же принципу, только на макроскопическом уровне, работает компьютерная томография, широко применяемая в медицинской диагностике). Затем, на основании всех вышеперечисленных данных, методом компьютерного моделирования (методом молекулярной динамики) были построены две модели капсида ВИЧ, изображенные на главной картинке.

А — cтроение пентамера и гексамера белка СА. Структуры из базы данных Protein Data Bank визуализированы с помощью программы PyMOL. B — белок СА состоит из двух доменов, соединенных гибким линкером. Если сравнить конформации белка СА в составе пентамера и в составе гексамера, то видно, что домены по-разному расположены относительно друг друга, так как белок способен изгибаться и скручиваться. Если сравнить разные гексамеры в составе одной структуры, то их форма может слегка отличаться, опять же из-за гибкости белковых молекул

При сравнении большого количества вирусных частиц становится заметно, что капсиды неоднородны по форме. Они могут содержать разное число гексамеров (обычно от 170 до 220), но всегда включают 12 пентамеров, необходимых для образования замкнутой структуры. Поэтому структуры, показанные на главной картинке, — это лишь два из множества возможных вариантов формы капсидов, существующих в природе.

Разнообразие форм частиц ВИЧ. Длина масштабного отрезка — 100 нм. Фото из статьи J. A. G. Briggs et al., 2003. Structural organization of authentic, mature HIV-1 virions and cores

Изучение структуры капсида полезно не только для фундаментального понимания того, как функционирует вирус, но и для создания нового класса противовирусных препаратов. На данный момент существует восемь различных классов препаратов против ВИЧ (нуклеозидные и не-нуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы, ингибиторы вирусной протеазы, ингибиторы слияния и т.д.), отличающихся друг от друга тем, с каким белком они связываются и какой этап жизненного цикла вируса они блокируют. Но все они обладают одним существенным недостатком: вирус со временем вырабатывает к ним устойчивость и препараты перестают действовать. Вирус иммунодефицита человека уникален тем, что в его геноме очень часто, гораздо чаще, чем у других болезнетворных вирусов, происходят мутации. Через некоторое время в организме пациента может появиться форма вируса с мутацией, делающей его устойчивым к действию принимаемого препарата. Эта форма получает эксклюзивную способность размножаться и передает эту мутацию дочерним вирусным частицам. В результате количество жизнеспособного вируса в крови пациента (вирусная нагрузка) увеличивается, иммунная система снова начинает разрушаться, и приходится подбирать новую схему лечения с другими препаратами. Поэтому создание новых лекарств, к которым вирус пока не выработал устойчивость, остается важной и актуальной задачей.

На данный момент не зарегистрировано ни одного препарата, воздействующего на капсид ВИЧ, но работа в этом направлении ведется. Компания Gilead разработала соединение GS-6207 (препарат Lencapavir). Оно связывается с поверхностью капсида ВИЧ, с двумя субъединицами белка CA одновременно и, во-первых, стабилизирует капсид, не давая ему после попадания в клетку реорганизоваться и высвободить геномную РНК и вирусные белки. Во-вторых, GS-6207 блокирует связывание капсида с ядерными порами, поэтому вирусный геном не может попасть в клеточное ядро и встроиться в геном клетки-хозяина.

А — химическая формула GS-6207 (Lencapavir). Рисунок с сайта commons.wikimedia.org. B — структура препарата Lencapavir (розовый), связанного с гексамером белка СA (голубой). Структура (PDB ID 6VKV) из базы данных Protein Data Bank визуализирована с помощью программы PyMOL

На момент написания этого текста (май 2021 года) GS-6207 (Lencapavir) проходит клинические испытания фазы 2/3 среди пациентов с формами вируса, устойчивыми к другим препаратам. Судя по предварительным результатам, Lencapavir хорошо переносится и вызывает снижение вирусной нагрузки у большинства пациентов. Большим его плюсом является то, что для эффективной борьбы с вирусом достаточно делать инъекции раз в полгода, в этом плане он гораздо удобнее большинства других антиретровирусных препаратов, которые нужно принимать каждый день. Возможно, его удастся применять не только для терапии ВИЧ-инфекции, но и для предотвращения заражения; клинические испытания по профилактике заражения в группах риска планируются в ближайшем будущем. Теоретически, и к Lencapavir’у вирус может со временем выработать устойчивость (хотя у пациентов, участвующих в клинических испытаниях, этого пока не произошло), но знания о его структуре и механизме действия помогут создать на его основе препараты следующего поколения, продолжив гонку, в которой медицинские химики соревнуются с эволюцией.

Рисунок Екатерины Кузиной, структуры из базы данных Protein Data Bank визуализированы с помощью программы PyMOL.

Екатерина Кузина