Пространственная биология

На фото — поперечный срез миндалин человека. Это скопления лимфоидной ткани в ротовой полости, которые стоят первыми на пути вдыхаемых или проглатываемых нами патогенов. На фото видны округлые фолликулы — ключевые функциональные структуры миндалин. В них образуются и созревают B-лимфоциты, осуществляющие гуморальный иммунный ответ.

Как и любые другие иммунные органы, миндалины имеют сложную клеточную архитектуру. Для ее визуализации используют методы пространственной биологии, в частности пространственной протеомики, когда окрашивают ткани на различные клеточные типы с помощью белков — маркеров клеток. Один из основных методов пространственной биологии — мультиплексная иммунофлуоресценция, которая и была использована для получения главного изображения. С ее помощью в ткани можно визуализировать десятки различных клеточных типов (при условии, что для каждого из них мы знаем специфический белок или маркер).

Суть метода можно описать так. Представим, что мы хотим разобраться в сложной структуре какой-либо ткани. Предположим, мы узнали, из каких клеточных типов состоит ткань (например, с помощью секвенирования РНК, которое позволяет найти уникальные для клеточных типов РНК), но не знаем их взаимное расположение, относительное количество, а также распределение внутри ткани. Дальше нам нужно обзавестись панелью маркеров — белков, уникальных для клеток одного типа. Концептуально, мы хотим, чтобы один маркер (или один клеточный тип) был виден нам на изображении как один цвет.

На помощь тут приходят антитела, конъюгированные (химическим путем скрепленные) с флуорофорами — химическими соединениями, способными принимать и испускать световую волну определенной длины, так что мы будем видеть это как тот или иной цвет. Специфические для наших уникальных маркеров антитела (маркеры выступают здесь в качестве антигенов) связываются с ними и при возбуждении волной определенной длины начинают «светиться». Таким образом, представим, что у нас есть пять уникальных маркеров, которые отражают пять клеточных типов внутри ткани. В таком случае мы будем использовать пять специфических антител и пять конъюгированных с ними флуорофоров.

Cхематичное изображение метода иммунофлуоресценции

Выше мы обсуждали самый простой вариант иммунофлуоресценции, традиционный метод, позволяющий использовать не больше пяти маркеров из-за спектрального перекрытия флуорофоров. При создании главного изображения использовался более изощренный и технически сложный метод под названием Immuno-SABER (immunostaining with signal amplification by exchange reaction — «иммуноокрашивание с усилением сигнала с помощью обменной реакции»). Он был создан коллективом ученых из Гарвардского университета и является одним из наиболее современных методов в пространственной протеомике.

В Immuno-SABER используется особый способ усиления, или амплификации, сигнала флуоресценции. Антитела в данном методе конъюгируют со специальными нуклеотидными последовательностями ДНК, которые затем комплементарно связывают более короткие последовательности, соединенные с флуорофорами. Такой метод позволяет усилить сигнал в 5–180 раз и использовать до десяти маркеров.

Сравнение традиционного метода окрашивания с помощью меченых антител и ImmunoSABER — линейного, разветвленного и разветвленного с заменой ветвей. Последний способ усиливает сигнал в 188 раз. Изображение из статьи S. K. Saka et al., 2019. Immuno-SABER enables highly multiplexed and amplified protein imaging in tissues

Для окрашивания среза миндалин на главном фото использовали четыре маркера с флуоресцентными метками, а также флуоресцентный синий краситель DAPI, который связывается с ДНК в ядрах клеток. Белок CD8a — это гликопротеин на поверхности T-киллеров, разновидности T-лимфоцитов, которые осуществляют непосредственное уничтожение чужеродных клеток в нашем организме (см. Клеточный иммунитет). Белок Ki-67 находится в ядре и необходим для клеточного деления. Последние два маркера сами являются антителами: это иммуноглобулины A (IgA), находящиеся на слизистых оболочках, и иммуноглобулины M (IgM), вырабатывающиеся первыми при распознавании чужеродного агента нашей иммунной системой. Чтобы прикрепить флуоресцентную метку, в данном случае используют вторичные антитела (см. картинку дня Иммуногистохимическое окрашивание).

Срез миндалин с главного фото и его увеличенный фрагмент. Изображение из статьи S. K. Saka et al., 2019. Immuno-SABER enables highly multiplexed and amplified protein imaging in tissues

Методы пространственной биологии получают всё большее применение в последние десятилетия. Такие мощные инструменты помогают нам понять, как устроены сложные клеточные образования с функциональной и, в большей степени, структурной точки зрения.

Поперечный срез сетчатки мыши, окрашенный с применением десяти маркеров. На объединенном изображение видны разные типы клеток ткани. Фото из статьи S. K. Saka et al., 2019. Immuno-SABER enables highly multiplexed and amplified protein imaging in tissues

Особенно часто подобный подход применяется в онкологии. Нам хорошо известно, что опухоли — это очень сложные системы, которые отличаются по строению и клеточному составу у разных пациентов. Именно поэтому препараты, которые действуют на одних пациентов, совершенно бесполезны для других. Таким образом, мы приходим к концепции персонализированной медицины, когда различные методы используются для описания уникальных характеристик опухоли конкретного пациента для подбора индивидуальных препаратов или их комбинаций, чтобы достичь наибольшего эффекта при терапии. Один из способов выяснения таких уникальных характеристик — это пространственная протеомика (как та, что мы видим на главном изображении).

Визуализация фолликула миндалины в разных каналах (при отдельном рассмотрении флуоресценции разных маркеров). Помимо уже известных нам маркеров, здесь использовались также расположенный в мембране T-лимфоцитов белок CD3e, участвующий в их активации; и PD-1, ответственный за сдерживание чрезмерной активации T-лимфоцитов. Длина масштабного отрезка — 100 мкм. Фото из статьи S. K. Saka et al., 2019. Immuno-SABER enables highly multiplexed and amplified protein imaging in tissues

Каким же образом разноцветное изображение опухоли может помочь нам подобрать персонализированное лечение для пациента? Если подобрать белки-маркеры, характеризующие некую уникальную особенность опухоли, то есть один цвет на изображении будет отражать одну особенность, мы сможем, например, оценить, как много иммунных клеток (другими словами, как много клеток одного определенного цвета) находятся в опухоли — в таком случае мы можем судить о том, будет ли работать иммунотерапия на этом пациенте. Или мы можем выяснить, какой именно подтип опухоли перед нами, чтобы подобрать лечение, которое чаще всего работает на этом конкретном подтипе. Другая особенность опухоли, которую может выявить пространственная протеомика, — это то, как много агрессивных (или, как это называют в онкологии, малодифференцированных) клеток в опухоли и как они внутри нее распределены. От этого может зависеть, как быстро опухоль будет развиваться.

Фото из статьи S. K. Saka et al., 2019. Immuno-SABER enables highly multiplexed and amplified protein imaging in tissues.

Расул Табиев