Полимеразная цепная реакция

Для проведения ПЦР необходимо подобрать праймеры — участки начала и конца размножаемого куска ДНК.

Итак, при ПЦР размножается только участок, ограниченный праймерами. Сразу понятно, как получить множество копий нужного гена для генно-инженерных целей: надо просто подобрать такие праймеры, которые будут ограничивать нужный участок. Праймеры эти должны быть уникальны и не повторяться больше нигде в геноме.

В принципе, та же задача стоит при выяснении наличия данного гена у данного вида живых существ. Если гена нет, ДНК размножаться не будет. Было ли размножение или его не было, можно будет понять, добавив к ПЦР-смеси краску, которая будет светиться при связывании с ДНК.

Таким же образом выясняется наличие или отсутствие инфекционного заболевания. Подбираются праймеры под какой-нибудь уникальный ген возбудителя, и если этот ген размножился в образце, значит возбудитель в нем присутствовал.

Прекрасно, но как же тогда определить мутацию в гене? Ведь сам ген будет присутствовать в геноме в любом случае — мутантный или нет.

Решение этой проблемы очень изящно и отличается для снипов и инсерций-делеций. Начнем со снипов.

Снип — это изменение в один нуклеотид. Чтобы понять, есть оно в данном гене или нет, мы подберем праймеры так, чтобы снип был внутри праймера. В результате если снип есть, то кусок ДНК будет размножаться, а если нет — то и нет.

Хорошо, но как тогда разобраться с крупными изменениями ДНК — инсерциями и делециями? Бывает ведь, что при мутации выпадают или вклиниваются повторяющиеся участки ДНК — то есть в нормальном гене, допустим 4 повтора данного участка, а в мутантном — 2 или, наоборот, 7. Как в этом случае подобрать праймер — ведь участки будут идентичны?

В этом случае мы подберем праймеры, которые будут окружать интересный нам участок с двух сторон. И когда этот участок размножится, мы прогоним продукты ПЦР на электрофорезе — эта методика позволяет разделить фрагменты ДНК по размеру. Короткий участок будет означать наличие делеции (или, наоборот, отсутствие инсерции), а длинный — отсутствие делеции (или, наоборот, наличие инсерции).

И наконец — родственники и преступники. Родственные связи и корни преступных событий с помощью ПЦР выясняются очень похожим способом. Дело в том, что в ДНК каждого человека есть особые повторяющиеся участки — микросателлиты. Однако у каждого человека эти микросателлиты разбросаны в своих участках генома; сходство в их распределении тем больше, чем ближе родственные связи между обладателями исследуемой ДНК. Если мы поставим ПЦР с праймерами на этих участках, то в результате получим уникальное распределение длин получившихся отрезков ДНК — генетический отпечаток пальца. У родственников такие «отпечатки пальцев» будут тем более похожи, чем ближе родство. Если же нам повезет обнаружить на месте преступления ДНК преступника, то нам достаточно будет сравнить его «отпечаток пальца» с «отпечатками пальцев» подозреваемых.

Это только краткое введение в увлекательный и загадочный мир ПЦР. За более чем 30 лет существования этой методики она получила множество модификаций — с ее помощью можно мгновенно измерять выход конечного продукта реакции, размножать ДНК на матрице РНК и даже изучать уровень метилирования гена (метилирование «выключает» ген — то есть хотя он и присутствует в геноме, но не работает). Одна из недавних модификаций называется LAMP и позволяет размножать ДНК без применения специальных приборов (см. Поиск иголки в стоге сена за 10 минут — подсвети себе LAMPой).