Просветленные грызуны

На фото — кровеносная система крысы, просветленной методом uDISCO и окрашенной красителем Texas Red Dextran при помощи перфузии.

Что делать, если анатомический объект имеет сложную пространственную структуру (нейрон с протяженным и разветвленным аксоном, сосуд и т. д.) и не помещается на одном гистологическом препарате? Обычно в таких случаях помогает техника серийных срезов: исследуемый орган нарезается на множество препаратов, а далее, зная их последовательность, можно послойно воссоздать интересующий вас объект. Эта работа весьма трудоемкая, приходится иметь дело с десятками и сотнями срезов, а хотелось бы получать такие изображения, что называется, «в один клик». Однако ткани малопрозрачны, и обычная световая микроскопия (см. Оптический микроскоп) фиксированного образца, например целого мозга, не даст сколько-нибудь высокого разрешения из-за сильного рассеивания света внутри препарата.

Для преодоления этой проблемы были разработаны методики просветления тканей, когда липиды и вода замещаются специальными смесями растворителей. Таков, например, метод получения трехмерных изображений органов, просветленных растворителем, 3DISCO (3D imaging of solvent-cleared organs), комбинированный с флуоресцентной микроскопией. Однако его недостатками были малая стабильность флуоресцентных белков и их быстрое выгорание в используемой смеси растворителей.

Недавно исследователям удалось усовершенствовать эту технику. Они подобрали такую смесь замещающих растворителей, которая продлевала время жизни флуоресцентных белков с нескольких дней до месяцев. Новый метод получил название uDISCO (ultimate DISCO).

Центральная нервная система мыши, нейроны которой экспрессируют зеленый флуоресцентный белок (GFP): a — общий вид головного и спинного мозга мыши в флуоресцентном микроскопе; b — общий вид мозга мыши, просветленного методом uDISCO; с — головной мозг мыши, флуоресцентная микроскопия светового листа; d–f — увеличенные участки головного мозга, видны тела нейронов и их отростки; g — дендритный отросток нейрона, заметны отдельные дендритные шипики (белые стрелки). Фото из статьи C. Pan et al., 2016. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO

В случае uDISCO просветляющая смесь состоит из бензилового спирта, бензил-бензоата, дифенилового эфира и α-токоферола (витамина E) в качестве антиоксиданта. Коэффициент преломления смеси близок к коэффициенту преломления костной ткани, так что при подготовке пробы не требуется проводить декальцинацию скелета. При обработке объекта смесью растворителей он изотропно сжимается примерно на 50%, что увеличивает разрешающую способность микроскопии (свет проходит меньший путь и рассеивается слабее).

Для получения изображения крупного объекта с микронным разрешением, например целого мозга мыши, можно использовать флуоресцентную микроскопию светового листа (light-sheet fluorescent microscopy).

Принципиальная схема флуоресцентной микроскопии светового листа. Объект освещается плоским пучком света (плоскость xy), направленным перпендикулярно оси объектива (ось z). При этом возбуждаются флуоресцентные белки, находящиеся только в заданной плоскости пучка, которая совпадает с фокальной плоскостью объектива. В результате получается оптический срез органа. Объемное сканирование образца достигается при перемещении предметного столика вдоль оси z — таким образом мы вместо серии гистологических срезов получаем серию оптических срезов, которые при помощи компьютерной обработки собираются в пространственную модель органа. Изображение из статьи A. Ertürk, F. Bradke, 2013. High-resolution imaging of entire organs by 3-dimensional imaging of solvent cleared organs (3DISCO)

Поскольку нейроны мыши содержали ген зеленого флуоресцентного белка (GFP) и экспрессировали его, они могли светиться при облучении светом определенной длины волны. Также методика uDISCO совместима с иммуногистохимическим окрашиванием и использованием квантовых точек.

Фото из статьи C. Pan et al., 2016. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO

Дмитрий Сутормин