Туфельки-убийцы

Разобравшись с ходом конъюгации и автогамии (рис. 1), подумайте, чем с точки зрения генетики скрещивание инфузорий отличается от обычного менделевского скрещивания.

Рис. 1. Автогамия у Paramecium aurelia. Каждый из двух микронуклеусов (Ми) делится мейозом, а затем 7 из 8 образовавшихся гаплоидных ядер дегенерируют. Оставшееся ядро делится митотически, и продукты его деления (пронуклеусы) сливаются в диплоидный синкарион («образование зиготы»). Дважды поделившись митозом, синкарион дает два Ми и два зачатка макронуклеуса (Ма). Старый Ма при автогамии, как и при конъюгации, разрушается. При следующем делении клетки делятся только Ми, и восстанавливается исходный набор ядер (один Ма и два Ми). Рисунок из книги: Чарльз Дэвид Эллис, Томас Дженювейн, Дэнни Рейнберг «Эпигенетика»

То, станет ли чувствительный партнер киллером после конъюгации, зависит от ее длительности.

Среди потомков чувствительных инфузорий, ставших киллерами, при автогамии тоже половина потомков остается киллерами, а половина становится чувствительными.

Упрощенная схема наследования «киллерного признака» у парамеций показана на рис. 2.

Рис. 2. Наследование «киллерного фенотипа» у парамеций (инфузорий) при кратковременной (a) и длительной (b) конъюгации с последующей автогамией. Рисунок с сайта bio3400.nicerweb.com

Подсказка 2 позволяет заподозрить, что признак этот связан с цитоплазматической наследственностью — ведь передача ядерного гена вряд ли может зависеть от длительности конъюгации. И действительно, «некие частицы» (их называют каппа-частицами) оказались цитоплазматическими эндосимбионтами туфелек, бактериями рода Caedibacter (далее в послесловии речь пойдет в основном про один вид этих бактерий — С. taeniospiralis). При длительной конъюгации партнерам передается не только ядро, но и порция цитоплазмы — а вместе с ней и каппа-частицы; и в результате они становятся киллерами.

Но почему тогда после аутогамии лишь половина гибридов от такого скрещивания сохраняет признак убийц? И почему среди потомков киллеров после конъюгации с чувствительным штаммом появляется половина чувствительных потомков?

То, что их половина — то есть что расщепление по этому признаку 1:1, — позволяет на этот раз заподозрить участие ядерных генов. И действительно, способность сохранять «киллерный фенотип» зависит (в первом приближении) от ядерного гена K. Приобретя доминантный аллель этого гена, инфузория может передавать «киллерный фенотип» потомкам. При гомозиготном генотипе kk каппа-частицы (даже если они получены при конъюгации или исходно жили в клетке) будут утрачены в ряду поколений, и клон станет чувствительным.

Итак, чувствительные клоны имеют генотип kk. Киллерный клон может иметь генотип KK или Kk, но если этот клон гетерозиготен, то он при автогамии будет давать и чувствительных туфелек (то есть будет не совсем клоном, а точнее, не чистой линией). В нашей задаче предполагается, что исходные киллеры имеют генотип KK. Тогда «гибридные» туфельки (после конъюгации киллеров и чувствительных) будут гетерозиготами Kk. Почему же при их «самооплодотворении» не произойдет расщепления 3:1, как при самоопылении гибридов F1 у гороха в опытах Менделя?

К стыду своему, при составлении задачи я долго в недоумении смотрел на схему скрещивания с рис. 2, хотя хорошо знаю особенности полового размножения инфузорий. Ответ элементарно прост: как при конъюгации, так и при автогамии после мейоза у туфелек гибнут все образовавшиеся ядра, кроме одного — независимо от исходного числа микронуклеусов. Только после этого единственное ядро делится митозом, и происходит обмен ядрами (при конъюгации) или их слияние (при автогамии). Например, на рис. 1 в подсказке 1 показан процесс мейоза и аутогамии у туфельки Paramecium aurelia, в клетке которой два микронуклеуса (Ми) и один макронуклеус (Ма). Каждый из двух Ми делится мейозом, а затем 7 из 8 образовавшихся гаплоидных ядер дегенерируют. Оставшееся ядро делится митотически, и продукты его деления (пронуклеусы) сливаются в диплоидный синкарион («образование зиготы»). Дважды поделившись митозом, синкарион дает два Ми и два зачатка Ма. Старый Ма при аутогамии, как и при конъюгации, разрушается. При следующем делении клетки делятся только Ми, и восстанавливается исходный набор ядер (один Ма и два Ми).

Оставшееся в живых после мейоза ядро, естественно, несет только один аллель из пары — с равной вероятностью K или k. Поэтому в одной клетке не могут остаться оба аллеля, и при аутогамии образуются только потомки с генотипами KK и kk в соотношении 1:1.

Вот почему среди потомства гетерозиготных туфелек будет поровну способных и неспособных сохранять «киллерный фенотип». На рис. 3 показаны генетические последствия мейоза и автогамии гетерозиготной туфельки.

Рис. 3. При мейозе и автогамии в клетке с равной вероятностью остается в живых ядро либо с двумя доминантными, либо с двумя рецессивными аллелями. Рисунок с сайта biobar.hbhcgz.cn

История изучения каппа-частиц довольно длительная и местами драматичная. Ее ранние этапы описаны в статье Джона Приера (J. R. Preer, 2006. Sonneborn and the Cytoplasm). Статья эта написана в 2006 году — примерно через 60 лет после того, как сам Приер начал работу с каппа-частицами. А открыл их в конце1930-х годов Трейси Соннеборн — один из крупнейших протозоологов XX века.

К концу 1940-х годов Соннеборн наоткрывал столько случаев и вариантов цитоплазматической наследственности у инфузорий, что это привело его к созданию теории плазмагенов (см. Наследственность цитоплазматическая). Он считал, что каждый ген создает свою самореплицирующуюся копию, которая присутствует в цитоплазме и размножается там. Но как раз в это же время другие ученые выдвинули предположение, что каппа-частицы — эндосимбиотические бактерии. Приеру и его сотрудникам удалось это доказать. Сначала Приер установил, что каппа-частицы можно элиминировать из клеток с помощью рентгеновских лучей. Попутно выяснилось, что размер «мишени» столь велик, что ее можно увидеть в световой микроскоп! И действительно — в цитоплазме туфелек удалось увидеть Фёльген-положительные (окрашенные по методу Роберта Фёльгена, то есть содержащие ДНК) частицы размером около 1 мкм. Затем с помощью электронного микроскопа удалось получить более детальные картинки, которые подтвердили, что каппа-частицы имеют морфологию клеток бактерий (рис. 4).

Рис. 4. Каппа-частицы — бактериальные клетки. На верхних фотоснимках внутри клеток видны R-тела (см. текст ниже). Фото из статьи: G. H. Beale, A. Jurand, J. R. Preer. The Classes of Endosymbiont of Paramecium aurelia

Наконец удалось выделить бактерий из инфузорий-киллеров и культивировать их в лаборатории, изучить их дыхание и другие биохимические процессы. Эти и другие факты постепенно убедили Соннеборна, что «теория плазмагенов мертва». В одном из своих писем в 1976 году он писал: «it was awful of me to be so attached to a pet idea. That was an ordeal between my mind and my heart and it took a while for the mind to win and the heart to accept. Impersonal scientific objectivity is a goal to be sought by hard self-discipline; we are not born with it.»

Тем временем изучение каппа-частиц (теперь носящих имя Caedibacter taeniospiralis и отнесенных к гамма-протеобактериям) продолжалось. Кроме генетических аспектов ученых интересовали и многие другие. Одна линия исследований была посвящена взаимоотношению туфелек-хозяев с симбионтами. Ясно, что способность избавляться от конкурентов — полезный признак. Но как влияют бактерии на туфелек, если конкурентов нет? Недавно было показано, что бактерии оказывают заметное влияние на транскриптом туфелек и заставляют клетки потреблять больше энергии. Оказалось, что конечный эффект при этом зависит от условий среды — состава пищи, температуры и других факторов. В одних условиях скорость роста популяции и конечная плотность возрастают, в других — снижаются. Иногда каппа-частицы из симбионтов могут превращаться в паразитов. Может быть, именно поэтому даже гомозиготные «киллерные» штаммы туфелек иногда избавляются от каппа-частиц.

Другие ученые сосредоточились на каппа-частицах как орудии убийства. Выяснилось, что среди каппа-частиц есть «блестящие» (светопреломляющие, «bright») и «неблестящие» («non-bright»). Только «неблестящие» бактерии могут делиться; только «блестящие» могут, выделяясь в среду, убивать чувствительные штаммы. Внутри «блестящих» бактерий обнаружились удивительные белковые конструкции — R-тела (рис. 5). Это свернутые в тугую «катушку» ленты из небольших структурных белков семейства Reb, нерастворимые и устойчивые к действию большинства денатурирующих агентов.

Рис. 5. Свернутые и развернутые R-тела под электронным микроскопом (внизу) и схема их строения (вверху). Изображение с сайта scicasts.com

Когда «блестящих» бактерий заглатывают туфельки чувствительных штаммов, после слияния их пищеварительных вакуолей с лизосомами и понижения pH R-тела разворачиваются, превращаясь в спирали с заостренными концами. Длина их увеличивается примерно в 40 раз, и они пробивают стенку бактерии и мембрану пищеварительной вакуоли. При этом из клеток C. taeniospiralis в клетку жертв поступает смертельный яд неизвестного состава (рис. 6).

Рис. 6. Механизм действия R-тел. При попадании в пищеварительные вакуоли чувствительного штамма и понижении pH R-тела разворачиваются, пробивают клетку бактерии и стенку пищеварительной вакуоли и доставляют в цитоплазму жертвы неизвестный токсин. Иллюстрация из статьи: J. K. Polka and P. A. Silver, 2016. A tunable protein piston that breaks membranes to release encapsulated cargo

Доказать это удалось, заставив трансгенных кишечных палочек производить R-тела. Скармливание таких кишечных палочек или очищенных R-тел чувствительным штаммам туфелек не приводило к их гибели (хотя R-тела исправно разворачивались). Так что действуют они, вероятно, не как смертельный стилет, а как шприц, делающий смертельную инъекцию.

Интересно, что белки R-тел у C. taeniospiralis закодированы на плазмиде, которая, вероятно, ведет свое происхождение от бактериофага (J. Jeblick, J. Kusch, 2005. Sequence, transcription activity, and evolutionary origin of the R-body coding plasmid pKAP298 from the intracellular parasitic bacterium Caedibacter taeniospiralis). В этой же плазмиде, видимо, закодирован и смертельный для туфелек токсин (хотя точно это не выяснено). Эта ситуация напоминает многие другие случаи «тройного» симбиоза бактерий, вирусов и их хозяев (см. Уникальный случай тройного симбиоза: вирус помогает бактерии защищать тлю от врагов, «Элементы», 29.08.2009).

Интерес к R-телам сильно возрос, когда оказалось, что они широко распространены среди свободноживущих симбиотических и паразитических бактерий, а также встречаются у патогенных амёб (акантамёб, способных вызывать кератит у человека). В большинстве случаев неизвестно, имеют ли отношение родственники каппа-частиц и R-тела к патогенности их хозяев. Но для одного случая взаимодействия азотфиксирующих бактерий с бобовыми показано, что в определенных условиях с помощью R-тел бактерии могут убивать клетки растения-хозяина.

Замечательно, что после разворачивания R-тела могут сворачиваться обратно при повышении pH. Такие устройства в конце концов привлекли внимание нанотехнологов. Двое ученых из Бостона (см. J. K. Polka and P. A. Silver, 2016. A tunable protein piston that breaks membranes to release encapsulated cargo) получили с помощью направленного мутагенеза гены, кодирующие R-тела с разной чувствительностью к pH, и клонировали их в сферопласты (клетки, лишенные клеточной стенки) кишечных палочек. Затем они показали, что при определенном значении pH эти R-тела развертываются и разрывают сферопласты. А это — один из путей к созданию нового способа доставки лекарств в клетки! Так что «экзотические фокусы» туфелек и их симбионтов могут оказаться новым словом в медицине.

А что же K-гены? Увы, ничего. То есть пока про них почти ничего не известно. Известно только, что доминирование K над k на самом деле неполное — содержание каппа-частиц в гетерозиготных туфельках примерно вдвое меньше, чем в гомозиготах KK. Ни белок, кодируемый этим геном, ни тем более механизм защиты киллеров от смерти при заглатывании «блестящих» бактерий не открыты. А ведь у туфелек есть еще альфа-, гамма-, дельта-, лямбда-, мю-, ню-, сигма- и тау-частицы...