Эволюция энхансера одного гена сделала людей самыми потливыми из приматов

Рис. 1. Схема, иллюстрирующая основные результаты обсуждаемого исследования. Эволюционные изменения в человеческой линии внутри последовательности обнаруженного учеными энхансера гена EN1, который в коже отвечает за формирование потовых желез, привели к более активной экспрессии гена и, как следствие, к повышению количества потовых желез в коже людей. Частично это обусловлено повышением сродства последовательностей внутри энхансера к транскрипционному фактору SP1. Рисунок из обсуждаемой статьи в PNAS

Развитие потовых желез в коже млекопитающих зависит от работы гена EN1. Белок, им кодируемый, — это транскрипционный фактор, от которого зависит включение экспрессии других генов. В недавнем исследовании был обнаружен один из энхансеров гена EN1, причем выяснилось, что его нуклеотидная последовательность у людей сильно отличается от других млекопитающих (в том числе и от ближайших родственников — человекообразных обезьян). Эксперименты на клеточных культурах и на модельных животных помогли убедиться, что именно изменения в этом энхансере привели к повышению экспрессии гена EN1 в коже человека и это, в свою очередь, привело к повышению плотности потовых желез на единицу площади поверхности тела. Этот же ген контролирует и развитие множества иных структур, экспрессируясь в других частях эмбриона. Однако там его активность регулируется через другие энхансеры. Такое устройство системы регуляции генов позволяет эффективно модифицировать одни признаки, не затрагивая другие, даже если эти признаки находятся под управлением одних и тех же генов-«дирижеров».

Человека иногда называют «голой обезьяной» из-за сильной редукции волосяного покрова на теле. Но представителей нашего вида вполне можно назвать и «потливыми обезьянами»: организм человека производит в 4–10 раз больше пота, чем шимпанзе (у людей выделяется до 1 л пота в час при сильной жаре). Потение является для нас основным способом охлаждения тела при повышенной температуре окружающей среды или при перегревании тела вследствие интенсивной мышечной работы. Предполагается, что все это стало особенно актуальным для наших предков, перешедших от жизни в лесу на деревьях к жизни в африканской саванне, где днем может сильно припекать солнышко, а добыча пропитания и жизнь в соседстве с крупными хищниками нередко вынуждали изрядно побегать. Собственно, основная версия при объяснении потери шерсти человеком тоже связана с тем, что потение как механизм терморегуляции работает эффективнее и быстрее, если испарение пота происходит с голой кожи.

Повышенное количество выделяемого пота обеспечивается большим количеством потовых желез: у человека плотность потовых желез, к примеру, на лице составляет 200 штук на см², что в 10 раз выше по сравнению со средней плотностью желез у макаки и шимпанзе. Доказательством важности этого признака служит тот факт, что люди с врожденной пониженной плотностью потовых желез особенно склонны к гипертермии (тепловому удару, см.: J. T. Wright et al., 2017. Hypohidrotic Ectodermal Dysplasia).

Отметим еще один интересный факт, касающийся анатомических особенностей наших близких и дальних родственников в устройстве системы потоотделения. Как известно, родственной группой для всех приматов являются грызуны. В самой группе приматов выделяется ветвь мокроносых приматов (в нее входят лори и лемуры), сохранивших более примитивные признаки, и ветка более прогрессивных сухоносых приматов (здесь мы найдем, к примеру, макак, капуцинов, шимпанзе и наш собственный вид). Так вот, потовые железы у всех грызунов и у мокроносых приматов имеются только на оголенных поверхностях ступней и ладоней — вероятнее всего, именно так располагались потовые железы у общего предка грызунов с приматами. А у сухоносых приматов потовые железы рассеяны по всему телу, что стало, вероятно, эволюционной инновацией в этой группе.

Потовые железы образуются в результате дифференцировки клеток эктодермы. Известно, что эта дифференцировка сопровождается активацией экспрессии гена транскрипционного фактора EN1. Причем этот ген не экспрессируется в тех клетках эктодермы, которые выбирают другие направления дифференцировки (например, формируют волосяные фолликулы или другие типы кожных желез). К тому же у людей была выявлена корреляция между уровнем экспрессии этого гена в коже и плотностью потовых желез, а у мышей была обнаружена связь аллельных полиморфизмов в этом гене с количеством потовых желез на подушечках стоп (у мышей потовые железы есть только в стопах на лапках).

Авторы статьи, опубликованной на прошлой неделе в журнале PNAS, поставили перед собой цель найти те изменения в самом гене EN1 или в регуляторных участках, контролирующих работу этого гена, которые обусловили эволюцию по вышеупомянутому фенотипическому признаку.

Аминокислотная последовательность белка EN1 человека, как выяснилось, ничем не отличается от таковой у всех прочих узконосых обезьян. Отсюда следует, что изменения следует искать регуляторных участках, через которые контролируется экспрессия EN1 — в промоторе или в энхансерах.

Поясним эти два термина. Промотор — это участок, находящийся вблизи от точки начала транскрипции гена (синтеза копии РНК), с которым должен связаться фермент, обеспечивающий транскрипцию, чтобы начать свою работу. Энхансер — это участок ДНК, который позволяет усиливать транскрипцию гена, связывая белки-активаторы (транскрипционные факторы). Располагаются энхансеры на некотором (иногда весьма большом, порядка сотен тысяч пар нуклеотидов) расстоянии от точки начала транскрипции, а один ген может регулироваться сразу несколькими энхансерами. Нередко у энхансеров есть тканевая специфичность — то есть один и тот же ген активируется в разных типах клеток при посредстве разных энхансеров. В частности, ген EN1 работает не только в кератиноцитах (клетках кожи), но и в некоторых других тканях эмбриона. Однако только в кератиноцитах он контролирует именно формирование потовых желез — в других частях эмбриона под его контролем развиваются совсем другие структуры (в частности, этот же ген важен для нормального развития нервной системы).

Схожая ситуация была описана в новости Змеи потеряли ноги из-за выключения гена Sonic hedgehog («Элементы», 03.11.2016): ген Shh участвует в развитии конечностей, но также и в развитии головного мозга. Благодаря тому, что его регуляция в разных частях эмбриона зависит от разных энхансеров, стали возможными серьезные эволюционные изменения работы Shh у змей, потерявших конечности (как следствие изменений одного из энхансеров этого гена), но сохранивших нормальное развитие мозга.

Итак, первой встала задача найти потенциальные энхансеры гена EN1, причем именно те, которые действуют в кератиноцитах. Сначала надо было ограничить область поиска. Для этого авторы получили в публичных базах данных сведения о характерном для кератиноцитов структурировании хромосом на домены TAD (Topologically associating domain). Такие домены являются, с одной стороны, структурными единицами — каждый TAD, представляя собой участок хромосомы, обособлен от соседних TAD в пространстве ядра. В то же время эти домены являются и функциональными единицами: насколько сегодня известно, ген и активирующие его энхансеры размещаются всегда в пределах единого домена TAD. Таким образом, ученые нашли интересующий их TAD, в который попадает ген EN1. Это оказался регион 2-й хромосомы длиной почти 900 000 пар оснований (Chr2: 118 000 000–118 880 000). В пределах этого TAD также обнаружились еще два гена (Insig2 и Ccdc93).

Энхансеры гена — функционально важные области, мутации в таких участках бывают обычно вредными и отсеиваются отбором. Следовательно, области энхансеров должны отличаться от других участков, не выполняющих каких-либо функций (а таких, в нашем геноме, как известно, порядка 90%), более высокой консервативностью. В пределах установленного TAD нашлось 209 консервативных участков с длиной от 50 нуклеотидов, лежащих вне белок-кодирующих областей. Это — черновой список последовательностей-кандидатов в искомые энхансеры. Авторы решили, что это слишком много, и провели дальнейшую фильтрацию. Известно, что энхансерам свойственны некоторые особые приметы (эпигенетические маркеры). Например, обычно с активными энхансерами бывают связаны ацетилированные гистоны. Также эти области можно опознать по более высокой доступности для разрезания ДНКазой — ввиду более «открытой» пространственной конформации хроматина. Еще одна примета, которую искали ученые, — совпадение участков-кандидатов с известными областями ускоренной эволюции у человека (HARs). Ведь, напомним, конечной целью было найти те изменения, благодаря которым люди стали потеть больше других приматов.

В итоге после процедуры фильтрации остался 41 участок, а с учетом близости расположения некоторых из них, конечный список последовательностей-кандидатов состоял из 23 фрагментов длиной 1–1,5 тысяч нуклеотидов (такова обычно бывает длина энхансера). Каждый элемент получил свой порядковый номер (ECE1–ECE23). Один из этих участков (ECE2) перекрывался с промотором гена EN1, остальные располагались на разном удалении от гена.

Теперь можно было переходить к следующему этапу — экспериментальной проверке работоспособности предсказанных энхансеров. Объектами для экспериментов стали животные (мыши) и клеточные культуры кератиноцитов — человеческие и мышиные.

Проверяемые фрагменты соединяли с генетической конструкцией, содержащий ген GFP (он кодирует зеленый флуоресцирующий белок медуз, который ученые часто применяют в качестве репортера в подобных экспериментах) с промотором, и вводили полученные конструкции в клетки эктодермы мышиных эмбрионов (использовали метод вирусной трансдукции). Заметим, что в этой серии экспериментов вместо человеческих последовательностей использовали гомологичные последовательности генома мышей. Когда мышатам исполнялось 2,5 дня — именно в этот срок у них происходит формирование потовых желез — готовили образцы тканей кожи с лапок, и окрашивали антителами к белку GFP. Из 23 фрагментов всего 5 (ECE2, ECE8, ECE18, ECE20, ECE23) дали положительный результат — белок GFP выявлялся в некоторых участках кожи на подушечках и между подушечками стоп, причем в этих же участках располагались и потовые железы. В трех случаях (ECE2, ECE18, ECE20) белок GFP также обнаружился и в коже оволосенной тыльной части лапок, хотя потовых желез там не было. Авторы отмечают, что это может быть интересно в контексте вопроса о том, как произошло распространение потовых желез за пределы поверхностей ладоней и стоп у сухоносых приматов.

Далее ученые сосредоточились на области ECE18, так как она содержит наибольшее число (четыре) консервативных элементов (потенциальных сайтов связывания каких-то транскрипционных факторов) и при этом перекрывается с одной из известных зон ускоренной эволюции, обозначаемой 2xHAR20. ECE18 располагается на расстоянии чуть менее 500 тысяч пар нуклеотидов от точки начала транскрипции гена EN1. Интересно, что в геноме мыши этот участок оказывается внутри интрона другого гена, Celrr (это видно на рис. 2), которого нет у человека. Очевидно, этот ген утратил функцию и превратился в псевдоген где-то в эволюции приматов.

Рис. 2. А — схема расположения 23-го участка-кандидата в пределах исследуемого TAD (показано расположение гомологичных мышиных последовательностей относительно мышиной хромосомы, но авторы указывают, что оно точно соответствует их расположению и в TAD хромосомы человека). Эти 23 участка показаны вертикальными чертами серого, оранжевого и красного цвета. Красным выделен участок ECE18 (он выделен еще и рамочкой), оранжевым — еще четыре участка, давшие положительный результат в тестах на энхансерную активность. B — структурная характеристика элемента ECE18 человека. Красным обозначен сам элемент, ниже серыми полосками показано перекрывание с известными HAR, синие полоски показывают обнаруженные авторами исследования консервативные участки. Ниже показана оценка уровня консервативности (сходства) вдоль всего ECE18 при сравнении разных видов млекопитающих. C — схема проведения первой серии экспериментов для установления энхансерной активности предсказанных регуляторных участков гена EN1. D — слева показана схема конструкций (контрольной и опытной), использованных для сравнения энхансерной активности вариантов последовательности ECE18, справа — пример окрашенных препаратов кожи подошвенных поверхностей лап мышат в контроле и при встраивании в конструкцию последовательностей ECE18 разных видов млекопитающих (шимпанзе, мыши, человека). Места, где присутствует белок GFP, окрашены в коричневый цвет, на такие места указывают стрелки. Рисунок из обсуждаемой статьи в PNAS

Чтобы получить количественную оценку эффективности энхансера, в новой серии экспериментов использовали конструкцию с другим репортерным геном — геном белка люциферазы. Продукцию белка можно измерить по интенсивности свечения люциферазы в клетках. Были созданы конструкции с геном люциферазы и гомологами ECE18 из разных видов млекопитающих: мыши, кошки, приматов — галаго (это представитель мокроносых обезьян), мармозетки, макаки, шимпанзе, человека. Конструкции вводили в кератиноциты человека (культивируемые вне организма). Продукция люциферазы существенно различалась: человеческий вариант последовательности обеспечивал в 13 раз более высокий сигнал люминесценции в сравнении с контролем (где энхансер отсутствовал) или с вариантами последовательностей из геномов мыши и галаго. По сравнению с последовательностями макаки и шимпанзе человеческий вариант последовательности давал в 2,6 и в 1,4 раза более высокий сигнал, соответственно.

Рис. 3. Анализ функциональности элемента ECE18 в серии люциферазных тестов на культуре кератиноцитов. А — схема, отражающая расположение в пределах последовательности ECE18 участка 2хHAR20, отдельно использованных в тестах частей этого элемента (FragA и FragB) и позиций, которые являются специфическими для человека в сравнении с предковой последовательностью у человекообразных обезьян (обозначены буквами от A до J). B — результаты тестирования цельных последовательностей ECE18 и разных ее модификаций на кератиноцитах человека (первым показан контрольный тест, далее — тест с гомологичной последовательностью шимпанзе (сECE18), с человеческим вариантом последовательности (hECE18), с фрагментами, соответствующими 2хHAR20, FragA и FragB, последние четыре отметки — полная человеческая последовательность с заменами отдельных нуклеотидов на варианты из последовательности шимпанзе: только в позиции А, только в позиции В, в обеих позициях сразу (А+В), во всех 12 позициях (A–J)). C — результаты тестирования последовательностей-гомологов ECE18 разных видов млекопитающих на человеческих кератиноцитах. D — результаты тестирования последовательностей-гомологов ECE18 разных видов млекопитающих на мышиных кератиноцитах. E — схема расположения двух сайтов связывания SP1 и различия в последовательностях этих сайтов у разных видов. Сайты связывания, соответственно попадающим в них специфическим человеческим позициям A и B были обозначены SP1^A и SP1^B. F — результаты тестирования конструкций с человеческим вариантом ECE18 с делециями сайтов SP1^A и SP1^B на человеческих кератиноцитах (левый график) и конструкций с FragA мышиного варианта ECE18 с добавленными сайтами SP1^A и SP1^B человека на мышиных кератиноцитах (правый график). Рисунок из обсуждаемой статьи в PNAS

Наконец, была проведена и серия экспериментов с использованием системы редактирования генома CRISPR/Cas9, чтобы внести целенаправленные изменения в геном и вмешаться в работу родного для клеток энхансера в естественном геномном окружении.

При введении в человеческие кератиноциты CRISPR-системы, вносящей повреждения в сайты связывания SP1, экспрессия белка EN1 заметно снижалась, что полностью согласуется с вышеописанными результатами люциферазных тестов. При этом экспрессия двух других генов из того же TAD не изменялась, то есть энхансер специализирован только на регуляции гена EN1.

Поработали и с генно-редактированными мышками. Мыши с искусственной делецией участка ECE18 из генома были совершенно обыкновенными, не отличаясь от контрольных ни по экспрессии гена EN1, ни по количеству формируемых на подушечках лап потовых желез (все это вполне согласуется с люциферазными тестами). Если эта область заменялась человеческим вариантом — экспрессия EN1 в кератиноцитах из кожи подушечек лап мышат возрастом 2,5 дня была повышена в сравнении с контрольными мышками. Увы, количество потовых желез при этом не отличалось от контроля. Однако ученые сделали хитрый ход. Они получили гибридных мышей, у которых в одной из хромосом ECE18 был вырезан, а во второй находился мышиный либо человеческий вариант последовательности. И вот в этом случае при наличии человеческого варианта ECE18 разница в количестве потовых желез все-таки появилась. Правда, не по всей поверхности кожи подошвы, а только в участках более тонкой кожи между подошвенными подушечками.

На основе изложенных результатов авторы делают следующие выводы. Во-первых, описанный механизм эволюции системы регуляции гена EN1 и формирования под его контролем потовых желез представляет наглядный пример того, что экспрессия гена может изменяться постепенно за счет последовательного накопления множественных мутаций в одном и том же регуляторном элементе, так что каждая мутация дополняет эффект предыдущих. Во-вторых, на будущее остаются вопросы о том, за счет чего на активность энхансера в области ECE18 влияют изменения, расположенные вне сайтов связывания транскрипционного фактора SP1; какую роль играют в эволюции эмбрионального развития потовых желез изменения в оставшихся четырех последовательностях-кандидатах (они также перекрываются с известными зонами ускоренной эволюции у человека); какие другие гены, помимо EN1, имеют отношение к эволюции системы потоотделения у приматов вообще и у человека в частности; и, наконец, какую роль играет комбинация изменений в разных частях системы регуляции, определяя особенности формирования потовых желез в разных группах млекопитающих.

Источник: Daniel Aldea, Yuji Atsuta, Blerina Kokalari, Stephen F. Schaffner, Rexxi D. Prasasya, Adam Aharoni, Heather L. Dingwall, Bailey Warder, Yana G. Kamberov. Repeated mutation of a developmental enhancer contributed to human thermoregulatory evolution // PNAS. 2021. DOI: 10.1073/pnas.2021722118.

Татьяна Романовская