Паразитизм в особо мелком размере: микоплазма и ее 40 промоторов

Михаил Орлов
«Природа» №2, 2020

Паразитизм — явление универсальное для биологической жизни. К какой бы систематической группе паразиты ни относились и какого размера они бы ни были, их приемы в целом совпадают. Развиваясь независимо, они, тем не менее, пришли к объединяющему их принципу «кинжал и мантия» — не брезгуют обманом, самозванством и внезапной жестокостью. На нижнем пределе размеров живого этим промышляют внутриклеточные паразиты — бактерии микоплазмы (Mollicutes). Как этим сильно упростившимся в процессе эволюции организмам, у которых нет даже жесткой клеточной стенки (от внешней среды их отделяет только мембрана из липопротеинов), удается ускользать от сложно устроенной иммунной системы хозяина, в общем известно. Для этого микоплазмы научились быстро переключать активность генов, кодирующих синтез липопротеинов, что делает паразита неузнаваемым. Однако среди микоплазм есть особо изощренный вредитель — Mycoplasma gallisepticum — распространенный патоген домашних и диких птиц, вызывающий у них респираторные заболевания, что приводит к значительным экономическим потерям во всем мире. Какие же механизмы использует эта «птичья» микоплазма, чтобы спасаться от иммунной системы?

Об авторе Михаил Анатольевич Орлов — аспирант и младший сотрудник лаборатории механизмов функционирования клеточного генома Института биофизики клетки РАН (Пущино). Область научных интересов — генетика прокариот, биоинформатика, нейрофизиология и экологическое моделирование. Номинант научно-популярного конкурса «Био/мол/текст — 2019»1.

Добиться успеха можно честным и кропотливым путем, а можно и схитрить. Верно это как в повседневной, так и в биологической жизни. В случае, когда на кону успех репродуктивный (т.е. максимальные численность и распространение), отъявленными жуликами можно назвать паразитов. Их можно встретить на всех уровнях организации живого и в различных царствах. Приемы они могут использовать поведенческие, морфологические, обманывающие восприятие или иммунитет. Есть даже своего рода паразитизм молекулярный, при этом замысел в целом сохраняется: прикинуться кем-то другим или стать незаметным, прокрасться к самому ценному и вероломно его присвоить. Слишком церемониться с хозяином нет нужды — его благополучие не входит в планы паразита, главное — уцелеть самому.

На передовой паразитического фронта находятся самые маленькие клеточные, а значит и живые (omnis cellula e cellula²), организмы. Их размеры менее 1 мкм (вплоть до 100 нм). Есть среди наноорганизмов и внутриклеточные паразиты (например, хламидии, риккетсии, листерии, коксиеллы, микоплазмы, и даже археи, которых в свое время выдворили из царства бактерий в отдельный домен), и честные свободноживущие бактерии, которые, например, обитают в глубинах океана.

Внутриклеточные паразиты — своего рода подрывники, поражающие различные клетки животных (в том числе и человека), включая специализированные (макрофаги) и неспециализированные (фагоциты), эпителиальные и эндотелиальные, а также клетки печени. Как только паразиты пробираются внутрь, им открывается возможность следовать различными путями в цитозоле (основой среде клетки) или изолированных вакуолях. Внеклеточным паразитам приходится иметь дело с гуморальными механизмами иммунитета хозяина и фагоцитозом, обойдя которые, они получают возможность внеклеточного размножения. Внутриклеточные же паразиты стремятся проникнуть главным образом в целевые хозяйские клетки, такие как макрофаги и эпителиальные клетки, где они могут благополучно размножиться. Успешная инфекция требует контакта паразита с определенной клеткой, содержимое которой представляет собой подходящую среду для роста бактерии. Таким образом, их жизнь протекает в пределах клетки, и некоторые из них при необходимости покинуть ее напрямую переходят в другую клетку, добавив к паразитизму еще один порок — домоседство. Однако большинство внутриклеточных паразитов временами могут жить и вне клетки, и именно в этот период у человека могут развиться опасные осложнения — например, сепсис [1].

Возникает естественный вопрос: такие ли уж внутриклеточные эти паразиты? Внутриклеточных паразитов принято делить на факультативных и облигатных в зависимости от их способности к самовоспроизводству в бесклеточной среде. Такое разделение выглядит не вполне корректным, поскольку «факультативный» паразит, хотя и прекрасно растет в бесклеточной (по сути — искусственно созданной) среде, внутри клетки размножается во время инфекции, а это необходимое и обязательное условие развития заболевания [2]. К тому же в жизненном цикле некоторых внеклеточных паразитов есть стадия, когда они проникают в клетку хозяина, вызывая у него патологические процессы.

Скользкий тип

В системе живого мира микоплазмам и их сородичам отведен отдельный класс бактериального царства — Mollicutes (от лат. mollis — ‘мягкий’, ‘гибкий’ и cutis — ‘кожа’). Слава у этого класса самая сомнительная. У них нет ни клеточной стенки, ни постоянной формы, да и перемещаются они, скользя по субстрату, а не при помощи флагелл-жгутиков, как все нормальные прокариоты. Их размер составляет всего около 0,2 мкм (200 нм). Паразиты-микоплазмы к тому же всеядны: и люди им подвержены (совсем уж «порочная» бактерия Mycoplasma genitalium), и различные животные, и даже растения [3].

Рис. 1. Портрет «преступника» — электронная микрофотография бактерии Mycoplasma gallisepticum [5]

Один из механизмов, позволяющих микоплазмам, да и другим внутриклеточным паразитам, маневренно обходить иммунную контратаку, — быстрые переключения экспрессии генов в формате «все или ничего» (англ. phase variation), называемые также расщеплением культуры. Такие переключения могут быть случайными или определяться тем же иммунным ответом хозяина [4].

В случае микоплазм к главным механизмам такого переключения относится смена репертуара поверхностных липопротеинов. Бактерия способна «интерактивно», т.е. отвечая на реакцию хозяина, менять липопротеины (молекулы-композиты — белки и липиды одновременно) на своей поверхности. А это мешает узнаванию и липопротеинов, и покрытых ими микоплазм. Известно несколько различных механизмов такого переключения, которые могут быть видоспецифичны или общими у близких видов. В их числе ошибки репликации, сайт-специфичная рекомбинация, генная конверсия и т.д. [3].

Рассмотрим уникальную в этом отношении микоплазму — M. gallisepticum (рис. 1). А начнем с того, что в ее случае механизмы смены репертуара поверхностных липопротеинов до конца не выяснены. Тем острее интерес!

Рис. 2. Сканирующая электронная микроскопия эритроцитов овцы (а) и курицы (б) после инфекции in vitro штаммом Mycoplasma gallisepticum Rlow [6]. Стрелки указывают на самих микоплазм или следы их внедрения на поверхности эритроцитов

M. gallisepticum — распространенный патоген домашних и диких птиц, вызывающий у них респираторные заболевания (рис. 2), что приводит к значительным экономическим потерям во всем мире. Как и положено представителю племени Mollicuta, клетка M. gallisepticum очень сильно упрощена. Соответствующим образом оказался «оптимизирован» и ее геном, который приобрел характерные черты генома внутриклеточного паразита. Живя на всем готовом, эта бактерия утратила многие метаболические и регуляторные пути. О масштабах потерь можно судить, взглянув на схемы регуляции транскрипции для трех представителей Mollicuta (рис. 3).

Рис. 3. Схематическое изображение сетей регуляции транскрипции у трех видов Mollicutes: Acholeplasma laidlawii (а), Spiroplasma melliferum (б), Mycoplasma gallisepticum (в). Изогнутая стрелка обозначает промотор; линия с Т-образным концом — репрессию, т.е. подавление активности; широкие стрелки с подписями — соответствующие гены. На гистограммах (г) показано количество транскрипционных факторов у всех трех бактерий

Эти схемы создали сотрудники группы системной биологии Mollicutes (лаборатория протеомного анализа Федерального научно-клинического центра физико-химической медицины), которые разработали новую методику, позволяющую точно идентифицировать координаты сайтов старта транскрипции (transcription start sites, TSSs) при разрешении одного нуклеотида³. Метод был применен для точного картирования TSS у трех видов Mollicutes: для свободноживущей бактерии Acholeplasma laidlawii, добывающей пропитание за счет взаимовыгодного (комменсального) симбиоза с растениями и использования разлагающегося субстрата; для паразита домашней пчелы Spiroplasma melliferum и для M. gallisepticum.

Среди немногочисленных описанных генов M. gallisepticum есть генное семейство гемагглютинина и вариабельного липопротеина — vlhA (от англ. variable lipoprotein and hemagglutinin). Повторимся: липопротеины — белки с липидной надстройкой, которые микоплазма способна активно менять. С гемагглютинином все несколько скучнее: он нужен патогену для взаимодействия с поверхностью хозяйской клетки. Функция vlhA-белков, однако, остается не выясненной до конца. По-видимому, они задействованы в адгезии («склеивании») клеток и проникновении паразита внутрь. Семейство включает немногим больше 40 генов, которые организованы в 3–5 кассет. Обращает на себя внимание, что структура промоторов (участок в начале каждого гена, с которого запускается транскрипция) таких генов существенно отличается от таковых других генов M. gallisepticum [3].

«Обычные» промоторы бактерий, управляющие экспрессией генов фазы активного роста культуры в «мирное время», имеют определенную консервативную (т.е. универсальную для всех в определенных участках) последовательность. Такие промоторы узнает выполняющий транскрипцию фермент РНК-полимераза в комплексе с субъединицей сигма-70. Это своего рода «вставляющаяся» часть составного комплекса на основе РНК-полимеразы — так называемого холофермента. Именно такой сигма-фактор определяет специфическое взаимодействие с промоторами некоторой группы. Промоторы же генов vlhA лишены консервативной последовательности, характерной для специфично узнающихся сигма-70 промоторов. Высказаны предположения, что гены vlhA могут иметь некоторую альтернативную сигма-субъединицу. Но самое, пожалуй, любопытное в них — область тринуклеотидных повторов GAA перед самой последовательностью генов. Такие повторы последовательности ДНК называются короткими тандемными (short sequence repeats, SSR), или микросателлитами⁴. В отличие от не повторяющихся участков ДНК, они эволюционируют иначе — в целом более изменчивы и динамичны. SSR характерны для самых различных геномов, и в случае прокариот обнаружены в генах, кодирующих различные факторы вирулентности. Именно они и придают патогенам патогенность. К числу таких генов принадлежат и ферменты — в частности, отвечающие за модификацию липополисахаридов или адгезинов (тоже служат для того, чтобы бактерия «пришвартовалась» к клетке-хозяину). Таким образом, микросателлиты делают возможными высокую генетическую и фенотипическую изменчивость, при этом область GAA-повторов M. gallisepticum может активно меняться — и по числу повторов, и по нуклеотидам в них. Такие изменения возникают как следствие ошибок репликации (англ. slipped strand mispairing), когда две комплементарные цепочки дуплекса ДНК могут принять неправильное расположение друг относительно друга и одна из них как бы проскальзывает (англ. to slip — ‘проскользнуть’) относительно другой. Свой вклад могут вносить также нарушения процессов репарации ДНК.

Очень интересно, что M. gallisepticum единовременно экспрессирует один и только один ген семейства vlhA. Ведь большинство факторов транскрипции и вообще соответствующей регуляции его редуцированный геном утратил. Как же M. gallispeticum удается менять различные режимы жизненного цикла (все та же phase variation) и переключать экспрессию семейства vlhA, оставив в положении «ВКЛ» всего один из них?

Как это работает?

Гены vlhA (значит, и соответствующие им промоторы) разбросаны по рекордно малому (менее 1 млн пар оснований) геному M. gallisepticum. GC-состав — тоже выдающийся, он равен 0,3, т.е. на тугоплавкие пары нуклеотидов G—C (формирующие между собой три водородные связи) приходится менее трети. На объединенные двумя водородными связями пары A—T, как нетрудно посчитать, остается все остальное (0,7). Система регуляции транскрипции предельно упрощена. Из факторов транскрипции — белков, связывающихся в регуляторной части гена и тем самым изменяющих его активность, — остались считанные единицы (см. рис. 3). Несмотря на это, данная микоплазма не просто эффективно меняет свои фазы жизненного цикла (атаковать — осваиваться — размножаться), но делает это чрезвычайно быстро [3]. В чем же ее секрет?

Таким образом, мы имеем немногим более 40 генов vlhA (у слабопатогенного штамма Rlow их, например, 43 [3]). Экспрессия этих генов контролируется соответствующими промоторами. Нам нужно включать то один, то другой из этих раскиданных по геному промоторов, всякий раз оставляя рабочим единственный. Первые эксперименты в этой области указывали, что активные гены семейства vlhA объединяет «черная метка» — присутствие ровно 12 тринуклеотидов GAA. И метка эта постоянно мутирует — просто в силу скачкообразной изменчивости микросателлитов. Что, в свою очередь, может влиять на то, какому гену включиться в определенный момент. Позднее выяснилось, что картина несколько сложнее [3].

Размеры GAA-трека навели исследователей на мысль о некотором гипотетическом «белке Х», который может на него садиться (рис. 4) [7]. Авторы соответствующей гипотезы указывали, что его связывание должно вызывать активацию экспрессии одного из генов семейства vlhA. Белок этот так и остался на бумаге — исследования в этой области не развивались.

Рис. 4. Схематическое изображение предполагаемого белка HAP (hemagglutinin protease) и место его связывания с последовательностями до и после 12 повторов GAA [7]. Числами указано расстояние (в нуклеотидах) до места начала транскрипции (transcription start site, TSS), буквами — участки расщепления нуклеиновой цепи рестриктазами (H, C и X)

Как иначе можно объяснить удивительно оперативную и способную «интерактивно» реагировать на иммунный ответ хозяина регуляцию транскрипции на фоне отсутствия стандартной машинерии? Мы предполагаем участие отдельного типа кодирования функции ДНК — а именно физических и структурных свойств ее двойной спирали. Нам привычно воспринимать эту молекулу как нечто «цифровое», инертное хранилище информации. И правда, кодирующие части генов состоят из триплетов, каждый из которых кодирует некоторую аминокислоту — своего рода команду вроде «начать / завершить считывание». Однако областей с такой самоочевидной функцией немного, особенно в сравнении с размером генома. В то же время регуляторные участки ДНК, т.е. определяющие переключения «потока» информации, при экспрессии генов реализуют свои функции иначе. В этом случае работает «код» не нуклеотидной последовательности (буквенный), а физических и структурных свойств дуплекса. Таким образом ДНК активно и даже настраиваемо участвует в регуляторных процессах.

Для чего это нужно?

Дело в том, что регуляция потока информации от ДНК к белку, включающая ее перекодирование, воспроизведение и «текущее обслуживание» ДНК, происходит благодаря различным ДНК-связывающим белкам, включая так называемые белки-катализаторы — ферменты. Они нередко руководствуются не строгими «словами» в их нуклеотидной последовательности, а особенностями структуры и физики дуплекса. В этом процессе могут быть важны различные характеристики ДНК — электростатический потенциал, термодинамические свойства, склонность к изгибам и т.д. Такое разнообразие связано со сложностью и многостадийностью самого процесса транскрипции.

Соответствующие данные получены нами ранее для другого шедевра внутриклеточного паразитизма — бактериофагов группы Т7 [8, 9]. Наиболее известный и изученный за последние несколько (!) десятков лет бактериофаг Т7 интересен тем, что представляет собой «геномный каскад». Это означает, что три части крошечного генома экспрессируются последовательно, одна за другой. При этом промоторы для персональной РНК-полимеразы фага (угадайте ее размеры) очень схожи, в ряде случаев — идентичны по последовательности.

А вот физические свойства дуплекса ДНК таких промоторов сильно отличаются. Это удалось показать для электростатического потенциала, направляющего самые первые взаимодействия промотора и РНК-полимеразы. Таким образом, данный параметр важен до непосредственного сближения промотора и РНК-полимеразы. Подобную картину нам удалось описать и для другого свойства — склонности промоторных участков ДНК плавиться при скручивании. Напомним, что под плавлением ДНК понимают расхождение цепей дуплекса друг от друга. Благодаря таким резким различиям в физике очень схожих по своему «тексту» промоторов становится возможным их быстрое и точное различение, а стало быть, и смена фаз жизненного цикла фага.

Подобное положение дел нам удалось описать и для нашего M. gallisepticum. С этой целью мы создали два датасета: в первый вошли промоторы vlhA из 12 различных штаммов M. gallispetium, во второй (для сравнения) — полный набор промоторов генов, не относящихся к семейству vlhA. Первым делом мы взглянули на их нуклеотидную последовательность или, как еще говорят, первичную структуру. Соответствующая визуализация последовательностей представлена на рис. 5 (изображение оригинальное, публикуется впервые). На ней легко заметить необычно длинные консервативные участки, непосредственно прилегающие к треку GAA-повторов с обеих сторон. Их протяженность делает их уникальными для прокариот. А ведь они еще и не имеют гомологов в каких-либо других геномах!

Рис. 5. Выравнивание для всех промоторов семейства vlhA из 12 различных штаммов M. gallisepticum (а) и полного набора прочих генов штамма S6 (б). Первые упорядочены таким образом, что имеющие более короткие GAA-треки расположены выше. Это позволяет легко различать их как желто-красную полосу. Правее них расположены области собственно промотора — ближайшая красно-синяя область (что соответствует обилию аденина и тимина). Создано на основе данных из [3]

В чем же особенность физических свойств этих особых промоторов? Используя методы моделирования, мы рассмотрели ряд доступных для вычислений параметров ДНК. Электростатический потенциал промоторов vlhA демонстрирует характерные паттерны в области, где ДНК связывается с промотором. Для промоторов группы «не-vlhA» таковых не наблюдается. Еще более интересным оказалось различие между этими группами по параметру с замысловатым названием — «вызванная суперспиральностью дестабилизация дуплекса ДНК» (stress-induced duplex destabilization, SIDD). Если коротко: она определяет, насколько легко ДНК плавится при определенной степени скрученности (к которой дуплекс может быть чувствителен). Промоторы группы vlhA оказались «тугоплавкими», что в целом нехарактерно для промоторов бактерий. Остальные же продемонстрировали высокую дестабилизацию, то есть стандартное легкое плавление дуплекса ДНК.

Подведем итоги: при помощи вычислений нам удалось показать существенные различия в физике между промоторами vlhA и «простыми» промоторами M. gallisepticum [3]. Что ж, теперь дело за экспериментаторами, которые помогут нам проверить и интерпретировать эти данные в «мокрых» (лабораторных) исследованиях. И выяснить назначение загадочных длинных консервативных последовательностей вокруг трека тандемных повторов.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект № 14-24-00159).

Литература
1. Stearns-Kurosawa D. J., Osuchowski M. F., Valentine C. et al. The pathogenesis of sepsis // Annu. Rev. Pathol. 2010; 6: 19–48. DOI: 10.1146/annurev-pathol-011110-130327.
2. Silva M. T. Classical labeling of bacterial pathogens according to their lifestyle in the host: inconsistencies and alternatives // Front. Microbio. 2012; 3: 71. DOI: 10.3389/fmicb.2012.00071.
3. Orlov M., Garanina I., Fisunov G. Y., Sorokin A. Comparative analysis of Mycoplasma gallisepticum vlhA promoters // Front. Genet. 2018; 9: 569. DOI: 10.3389/fgene.2018.00569.
4. Henderson I. R., Owen P., Nataro J. P. Molecular switches — the ON and OFF of bacterial phase variation // Mol. Microbiol. 1999; 33: 919–932. DOI: 10.1046/j.1365-2958.1999.01555.x.
5. Catroxo M. H. B., Martins A. M. C. R. P. F. Veterinary Diagnostic using Transmission Electron Microscopy // The Transmission Electron Microscope — Theory and Applications. 2015; 14: 327–350. DOI: 10.5772/61125.
6. Vogl G., Plaickner A., Szathmary S. L. et al. Mycoplasma gallisepticum invades chicken erythrocytes during infection // Infection and Immunity. 2008; 76(1): 71–77. DOI: 10.1128/IAI.00871-07.
7. Liu L., Panangala V. S., Dybvig K. Trinucleotide GAA repeats dictate pMGA gene expression in Mycoplasma gallisepticum by affecting spacing between flanking regions // Journal of Bacteriology. 2002; 184(5): 1335–1339. DOI: 10.1128/JB.184.5.1335-1339.2002.
8. Орлов М. А., Камзолова С. Г., Рясик А. А. и др. Профили вызванной суперспирализацией дестабилизации дуплекса ДНК (SIDD) для промоторов бактериофага T7 // Компьютерные исследования и моделирование. 2018; 6: 867–878. DOI: 10.20537/2076-7633-2018-10-6-867-878.
9. Орлов М. А., Рясик А. А., Сорокин А. А. Дестабилизация дуплекса ДНК активно реплицирующихся промоторов бактериофагов группы Т7 // Молекул. биол. 2018; 52(5): 793–800. DOI: 10.1134/S0026898418050117.

¹ По договоренности с организаторами конкурса «Био/мол/ текст-2019» мы публикуем переработанный вариант статьи «Али-Баба и 40 промоторов», участвовавшей в конкурсе в номинации «Своя работа». — Примеч. ред.

² Тезис omnis cellula e cellula (‘клетка происходит только от клетки’) ввел Рудольф Вирхов (Rudolf Virchov; 1821–1902) — немецкий ученый, один из основоположников клеточной теории в биологии и клеточной патологии в медицине.

³ Подробнее с методикой и результатами исследований Mollicutes можно ознакомиться на сайте System biology database of Mollicutes (SMDB).

⁴ Подробнее см.: Орлов М. А. Короткие тандемные повторы // Природа. 2019. № 12. С. 27–33.