Пусть ворона сохнет, или Как устроены суточные циклы

Достаточно понять, как можно обеспечить цикличность работы одной клетки.

Некоторые белки — транскрипционные факторы — умеют управлять транскрипцией генов других белков.

Итак, как же можно обеспечить автономную цикличность работы одной клетки? Самый очевидный, напрашивающийся ответ — простейшая петля отрицательной обратной связи:

В клетке есть некий белок А, являющийся сам для себя репрессирующим (то есть выключающим транскрипцию) транскрипционным фактором. Экспрессия этого белка может начаться только тогда, когда этого белка в клетке нет. Когда белок появляется, он выключает собственную транскрипцию, из-за чего его уровень падает и цикл начинается заново. Цикл занимает относительно много времени (вначале транскрибируется мРНК, потом эта мРНК выходит из ядра в цитоплазму, потом в цитоплазме с мРНК транслируется белок, а потом этот белок возвращается в ядро и выключает собственную транскрипцию), и с помощью различных ухищрений (регуляции времени жизни мРНК и экспорта ее из ядра, регуляции импорта белка в ядро) можно «подкрутить» его до 24 часов.

Однако эта система слишком «шумная», неточная и ненадежная. Уровень одного-единственного белка может колебаться по множеству причин, не связанных с уровнем его транскрипции, а в результате суточные ритмы начнут скакать в разные стороны.

Более стабильной будет система не с одним, а сразу с двумя белками — А и Б — и, соответственно, с двумя петлями обратной связи — положительной и отрицательной. А является транскрипционным фактором для Б, а Б — для А. А запускает транскрипцию Б (то есть в отсутствие А не идет экспрессия Б; это положительная петля обратной связи), а Б останавливает транскрипцию А (то есть в присутствии Б не идет экспрессия А; это отрицательная петля). В результате получается такой цикл:

В клетке нет А и Б → Запускается транскрипция А → В клетке есть А и нет Б → Запускается транскрипция Б → В клетке есть А и Б → Выключается транскрипция А → В клетке нет А и есть Б → Выключается транскрипция Б → В клетке нет А и Б (и всё сначала).

В реальной же клетке млекопитающих всё происходит еще немного сложнее:

Белков не два, а четыре. Они называются CLOCK (circadian locomotor output cycles kaput; в слегка вольном переводе — «капут суточным ритмам»; это потому, что если его выключить, то ритмы нарушаются), BMAL1 (brain and muscle aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator (ARNT)-like 1 — мозговой и мускульный аналог рецептора ARNT-1), PER (Period — период; если точнее, то это не один белок, а три похожих — PER1, PER2 и PER3) и CRY (криптохром; а точнее, два похожих белка — CRY1 и CRY2). Белки работают попарно: CLOCK и BMAL1, объединившись в комплекс, запускают транскрипцию PER и CRY (то есть вдвоем работают как один белок А из вышеизложенного цикла), а PER и CRY, тоже в комплексе, останавливают транскрипцию CLOCK и BMAL1 (то есть вместе представляют из себя белок Б). Такая «парная» работа делает систему более стабильной и не позволяет циклу сбиться из-за случайных изменений уровня одного из белков.

Кроме того, есть отдельные петли, касающиеся белка BMAL1: он запускает сразу два каскада — «дружественный», который активирует его транскрипцию и «враждебный», который эту транскрипцию выключает. Таким образом, количество белка BMAL1 оказывается отъюстировано лучше, чем для других белков суточных ритмов (правда, может быть аналогичные каскады для других белков просто еще не обнаружены).

Рис. 1. «Часы» млекопитающих. Белки CLOCK и BMAL1 запускают транскрипцию белков PER и CRY (показано стрелочками, упирающимися в E-box — участок ДНК, расположенный перед промотором и необходимый для присоединения транскрипционного фактора), а PER и CRY, наоборот, останавливают транскрипцию CLOCK и BMAL1 (показано линией, которая заканчивается перпендикуляром). В то же время, белок BMAL1 регулирует собственное количество с помощью двух каскадов — запускающего транскрипцию BMAL1 с помощью белка Rev-ErbA и останавливающего эту транскрипцию благодаря белку RORa. Изображение с сайта en.wikipedia.org

Личные часики и общие куранты

Циклы белков CLOCK, BMAL1, PER и CRY крутятся не только в клетках супрахиазмального ядра (СХЯ), но и во всех клетках нашего тела. То есть в каждой клетке тикают свои личные часики, и ее метаболизм тоже подлажен под 24-часовой цикл. Даже клетки, извлеченные из организма и живущие в культуре, показывают суточные метаболические колебания. СХЯ же нужно в качестве «курантов», которые сообщают часам в каждой клетке точное время. Как именно СХЯ синхронизирует суточные ритмы в отдельных клетках, не до конца понятно. Возможно, эта синхронизация связана с изменениями температуры (см. об этом: Предложена гипотеза, объясняющая механизм синхронизации биоритмов в организме, «Элементы», 16.11.2010).

Слепые и зрячие

С точки зрения банальной эрудиции сразу понятно, что вышеописанная схема неполная. Если бы в организме существовали только такие «слепые», не обращающие внимания на световой день, часы, то мы не смогли бы, например, приспосабливаться к смене часовых поясов при авиаперелетах и, попав на другую сторону земли, спали бы днем и бодрствовали ночью.

И действительно, у часов есть не только «слепая» часть, но и «зрячая». Группа клеток в нижней части супрахиазмального ядра получает сигнал об освещенности от фоточувствительных ганглионарных клеток сетчатки (см. Intrinsically photosensitive retinal ganglion cells), благодаря чему остальные, «слепые», клетки СХЯ подстраиваются под световой день (см. об этом Синий и зеленый свет будят человека по-разному, «Элементы», 04.06.2010).

Вышесказанное относится к суточным ритмам млекопитающих. Почти так же устроены «часы» насекомых (рис. 2).

Рис. 2. «Часы» насекомых на примере плодовой мушки Drosophila melanogaster. У насекомых, как и у млекопитающих, в «часах» тоже работают две пары белков, являющиеся транскрипционными факторами друг для друга, только вместо криптохромов используется белок Timeless (сокращенно — TIM, в переводе означает «лишенный чувства ритма»), а вместо BMAL1 — Cycle (сокращенно — CYC, означает, разумеется, «цикл»). При этом белок CLOCK регулирует собственную экспрессию с помощью петли обратной связи, включающей белки VRI и PDP1. Криптохром в данных часах непосредственно не работает, а используется, поскольку он светочувствителен, для подстройки суточных ритмов к световому дню. После освещения синим светом криптохром активируется и соединяется с комплексом PER–TIM, что приводит к самым печальным последствиям для этого комплекса — распаду и уничтожению белка TIM через протеасому. Однократный пульс света не может сильно сдвинуть ритмы, а вот под постоянную и ритмичную смену освещения организм с помощью этого механизма может подладиться. Изображение из статьи Antonio Carlos Alves Meireles-Filho, Charalambos Panayiotis Kyriacou, 2013. Circadian rhythms in insect disease vectors

«Часы» грибов имеют сходную конструкцию, правда немного отличаются в деталях (рис. 3).

Рис. 3. «Часы» грибов на примере нейроспоры густой (Neurospora crassa). В этих часах также наблюдается две петли обратной связи — положительная и отрицательная. Однако если положительную петлю запускает пара белков — WC1 и WC2 (WC, кстати, значит White collar, «белый воротничок»), то отрицательная петля запускается только одним белком по имени FRQ (Frequency, «частота»). Большое значение имеет утилизация FRQ, которая происходит с помощью фосфорилирования. FRQ попадает «в лапы» к ферменту, который навешивает на него фосфатные группы. В таком виде FRQ имеет большее сродство к своему «палачу» — убиквитин-лигазе FWD-1 — и потому быстро уничтожается. (Убиквитин-лигазы — это белки, которые препровождают другие белки в клеточную «машину смерти» — протеасому). Только фосфорилированный, «обреченный на смерть», FRQ может остановить работу своих «антиподов», «белых воротничков» — возможно, так удается избежать «зашумления» из-за случайно повышенного уровня этого белка. Причем FRQ не останавливает белым воротничкам транскрипцию (как это происходит в «часах» животных), а просто отцепляет их от своего промотора (останавливая запуск собственной транскрипции) и способствует их расщеплению. Изображение из обзора John B. Hogenesch & Hiroki R. Ueda, 2011. Understanding systems-level properties: timely stories from the study of clocks

Поскольку растения зависят от освещения куда больше, чем животные, механизм регуляции суточных ритмов у них гораздо сложнее (зато, видимо, и надежнее) чем у животных. Схема суточных ритмов растений вызывает что-то среднее между страхом и восторгом (рис. 4).

Рис. 4. «Часы» растений на примере излюбленной модели физиологов растений резуховидки Таля (Arabidopsis thaliana). Этот механизм включает целых три петли обратной связи — центральную, утреннюю и вечернюю. Помимо запуска и остановки транскрипции, у растений большое значение имеет также запуск и остановка трансляции, то есть синтеза белка на основе мРНК. мРНК на данном рисунке показана в виде прямоугольника с торчащими в две стороны короткими отрезками. Пунктирная стрелка соединяет мРНК с ее продуктом — белком. Белки фитохромы (PHY) и криптохромы (CRY) не участвуют в самой работе часов, а только передают информацию об освещенности красным и синим светом соответственно. Подробности работы прочих белков показаны на схеме, но не расшифрованы в подписи в целях экономии нервов читателя. Желтый кружок справа вверху — это солнце, полумесяц слева внизу — луна. Изображение из обзора Z. Jeffrey Chen, 2013. Genomic and epigenetic insights into the molecular bases of heterosis

Наконец, более-менее разобравшись с эукариотами (счастливыми обладателями клеточных ядер), обратим свой взор на куда более простых в устройстве прокариот — бактерий и архей, — которые ядер лишены. Одни из самых примитивных организмов, обладающих суточными ритмами, — это цианобактерии. Их «часы» уникальны потому, что в отличие от часов животных, грибов и растений никак не связаны с регуляцией транскрипции или трансляции (рис. 5).

Рис. 5. «Часы» цианобактерий на примере Synechococcus elongatus. В клетке цианобактерий есть три белка — KaiA, KaiB и KaiC («Kai» по-японски значит «цикл»; на рисунке эти белки названы просто A, B и C). Шесть молекул белка KaiC объединены в комплекс; к этому комплексу присоединяется белок KaiA. Это присоединение вызывает фосфорилирование белка KaiС вначале по одному сайту (показано розовыми кружочками), а потом по другому (показано желтыми кружочками). К полностью фосфорилированному комплексу имеет сродство белок KaiB; его присоединение вызывает дефосфорилирование данного комплекса по «розовому» сайту. После этого KaiB отваливается (ведь комплекс уже не полностью фосфорилирован), а комплекс продолжает дефосфорилироваться дальше (потому что фосфорилирование по «желтому» сайту без «розового» нестабильно). В результате остается комплекс из шести белков KaiC и одного KaiA, с которого всё начиналось, и цикл повторяется. Изображение из статьи C. Robertson McClung, 2007. The cyanobacterial circadian clock is based on the intrinsic ATPase activity of KaiC