Голубая роза

В каких органеллах растительной клетки есть генетическая информация?

Чем отличаются процессы реализации генетической информации в ядре и в хлоропласте растений? Как отличается наследование генетической информации через эти органеллы?

А. Представьте, что перед вами стоит задача повторить этот эксперимент. Как именно нужно модифицировать геном исходной красной розы, чтобы изменить ее цвет? Как вы думаете, что помешало добиться чисто голубого цвета?

Первый шаг — выяснить, какие именно вещества придают цвет лепесткам и какие гены ответственны за их синтез.

Красные, синие и фиолетовые пигменты растений — это антоцианы. У розы есть система синтеза антоцианов, но она не «сворачивает» к голубому дельфинидину (Delphinidin; см. рис. 1). Значит, нужно найти недостающие гены синтеза дельфинидина — а розе, как выяснилось, недостает гидроксилаз из семейства цитохромов P450 (см. Y. Tanaka, F. Brugliera, 2013. Flower colour and cytochromes P450).

Рис. 1. Схема завершающих этапов синтеза антоцианов у растений. В зависимости от набора ферментов общий предшественник может стать пигментом красного, синего или даже оранжевого цвета. Схема не полная. Изображение с сайта suntory.com

Проще всего взять эти недостающие гены из растений с синими или голубыми лепестками (хотя в конце 80-х, когда возникла идея создать голубую розу, сама по себе задача найти эти гены уже была нетривиальной!). У этих генов будет и еще одно преимущество: их регуляторные области и промоторы будут обеспечивать синтез дельфинидина именно в лепестках, а не в плодах, листьях или корнях. Впрочем, если найти соответствующие регуляторные области у самой розы и встроить их в нужные регионы перед последовательностью, кодирующей ген, они будут работать лучше.

Рис. 2. Цветовая гамма, которую дают самые распространенные антоцианы. Рисунок из статьи A. Ananga et al., 2013. Production of Anthocyanins in Grape Cell Cultures: A Potential Source of Raw Material for Pharmaceutical, Food, and Cosmetic Industries

Как доставить гены в ядра клеток растения? Для двудольных растений, к которым относится и роза, отлично подходит вектор на основе Ti-плазмиды бактерии Agrobacterium tumefaciens. Эта бактерия — природный генный инженер: ее плазмида проникает в клетки растения и модифицирует их таким образом, чтобы клетки синтезировали вещества, необходимые для питания бактерии. Есть и другие способы генетической трансформации растений, но этот относительно прост и надежен. Подробно о трансформации с использованием вектора на основе Ti-плазмиды и других методах вы можете прочитать здесь.

Вы хотите ждать цветения ваших модифицированных роз, чтобы узнать, встроились ли гены или нет? Если не хотите (а ждать пришлось бы не меньше года), то кроме генов синтеза дельфинидина в вектор нужно внедрить гены, по которым можно было узнать, успешна ли модификация, прямо в чашке Петри с каллусной культурой растений (см. картинку дня Микрокартофель). Каллус — это комочек растительных клеток, которые еще не приобрели специализацию и могут стать какими угодно. Воздействуя на каллус растительными гормонами и меняя их концентрации, можно заставить его отращивать попеременно побеги и корешки — то есть, в перспективе, из него можно вырастить целое взрослое растение.

Можно внести в вектор гены устойчивости к гербицидам или антибиотикам — в таком случае, если добавить эти вещества к среде в чашке Петри, выживут только трансформированные клетки растений. Можно внести гены, которые дают то или иное преимущество, — тогда трансформированные растения можно будет узнать по скорости роста или возможности использовать необычный источник питания. Можно добавить какой-то видимый признак, например флуоресцентный белок. Пигмент, конечно, тоже видимый признак, но его появления надо слишком долго ждать.

Если мы встраиваем в растение гены устойчивости к антибиотикам или пестицидам и собираемся выращивать это растение за пределами лаборатории, было бы здорово потом эти гены вырезать — чтобы они каким-либо способом не «утекли» в природу. Самый распространенный способ их вырезать — Cre-lox рекомбинацию (Cre-Lox_recombination; см. здесь или здесь) — «подсмотрели» у бактериофагов, которые с помощью этой системы делают из линейной молекулы ДНК кольцевую.

Что еще может быть важно? Чтобы увидеть синий цвет (а не смесь синего цвета с исходным цветом лепестков), необходимо сломать или подавить синтез собственного пигмента розы — цианидинов (Cyanidin), пеларгонинов (Pelargonin) или каротиноидов.

Подавить его можно с помощью РНК-интерференции. В 1990 году исследователи собирались создать генно-модифицированные петунии с более насыщенным цветом. В них добавили несколько копий их же собственных генов, ответственных за синтез пигмента. Но получили лепестки с белыми пятнами. Оказывается, лишняя копия гена может подавлять его экспрессию (реализацию)! Похоже, что сначала с них активно транскрибируется информационная РНК (мРНК). Но этой РНК очень много, она начинает формировать нетипичные вторичные структуры с двухцепочечными участками. Эти двухцепочечные участки и запускают систему РНК-интерференции: разрушение тех мРНК, у которые есть комплементарные к этим двухцепочечным участкам фрагменты.

Поэтому, если мы хотим нарушить работу гена, можно вставить в вектор этот ген еще несколько раз. Еще лучше не только вставить в вектор копию гена, но и отдельно вынести под активный промотор комплементарную к нему последовательность: две синтезированные с этих участков молекулы РНК свяжутся друг с другом и образуют двухцепочечные молекулы РНК.

Более надежным, чем РНК-интерференция, будет внесение мутаций в ген, ответственный за последнюю стадию синтеза пигмента, — например, с помощью системы CRISP-Cas, но оно потребует отдельного этапа. Третий вариант — можно взять для модификации белые розы. Но в этом случае надо точно знать, где именно сломался путь синтеза антоцианов, и полностью его починить. (А если сломался не сам синтез антоцианов?)

Итого, что должно быть в нашем векторе? Гены синтеза дельфинидина — последних этапов, которых нет у розы. Гены, которые позволят обнаружить трансформированные растения на стадии каллуса (и, желательно, система, которая позволит эти метки удалить). И собственные гены последних этапов синтеза красного пигмента розы, чтобы его подавить.

Что же может помешать добиться чисто синего цвета?

Во-первых, свойства дельфинидина и слабо кислая среда в вакуоли лепестков. Дельфинидин, как и многие другие антоцианы, меняет свой цвет в зависимости от кислотности среды (вы пробовали добавить соду или раствор щелочи в малиновый или черничный сок, заваренный чай каркаде, сок черной смородины?). При повышении кислотности дельфинидин приобретает фиолетовый оттенок.

Во-вторых, РНК-интерференция — это механизм, который позволяет защищаться от чужеродной ДНК. Поэтому есть вероятность, что растение подавляет экспрессию генов синтеза дельфинидина. Об  РНК-интерференции в трансгенных растениях см. статью S. Rajeevkumar et al., 2015. Epigenetic silencing in transgenic plants.

О реальной истории создания голубой розы читайте в послесловии.

Б. Представьте, что вы хотите пересадить в картофель ген животного и хотите, чтобы продукт этого гена, белок, накапливался в значительных количествах в картофельных клубнях. Какие у вас есть способы это сделать и с какими проблемами вы столкнетесь при реализации этих способов?

Вы уже узнали про РНК-интерференцию и то, как она подавляет экспрессию встроенных в растение чужих генов. Это основная проблема, встающая на пути трансформации ядерной ДНК растений. Можно ли ее избежать, чтобы добиться высокого выхода продукта?

В клетке растения есть три органеллы, содержащие ДНК. Помимо ядра это еще митохондрии и пластиды (пластиды — это более общее слово для хлоропластов, описывающее стадии, когда они не являются фотосинтезирующими органеллами, например в семени, в зрелом плоде или в желтом осеннем листе). Это вторая основная мишень для генетической инженерии. В пластидах и митохондриях нет РНК-интерференции; кроме того, пластиды в растении — это место синтеза множества дополнительных веществ: жирных кислот, каротиноидов. Вполне реально заставить их синтезировать что-то еще.

Мы сразу сталкиваемся с двумя проблемами. Первая — пластиды нельзя модифицировать Ti-плазмидой. Для них разработаны отдельные вектора, и доставить их в клетку растения тоже нужно другим путем (например, генной пушкой или прямой инъекцией в пластиду, хотя для такой инъекции надо быть очень ловким).

Вторая. Если мы хотим встроить в пластиды ген животного, необходимо учесть, что это будет эукариотический ген с экзонами и интронами. Интроны должны быть вырезаны в процессе сплайсинга. Если мы встраиваем ген животного в ядро растения, то система сплайсинга растения с этим справится. А вот в пластидах системы сплайсинга нет. Значит, мы не можем просто копировать нужный ген из генома животного с помощью ПЦР. Скорее всего, нам потребуется найти мРНК этого гена и провести с нее обратную транскрипцию. А лучше всего вообще серьезно переделать нужный ген. Оптимизировать его по составу нуклеотидов (содержание пар G-C — важный показатель) и по частоте использования разных кодонов (вы помните, что одна аминокислота может кодироваться несколькими разными кодонами?). Частота использования кодонов и количество соответствующих тРНК у разных организмов может быть разной. И если в гене белка, который мы встраиваем в хлоропласт, будет кодон, для которого в хлоропласте мало тРНК, мы получим низкий выход продукта без всякой РНК-интерференции.

Кроме того, нельзя забывать о промоторах и регуляторных последовательностях. В случае с синей розой исследователи брали гены, которые и так работали в лепестках, — их регуляторные последовательности заведомо неплохо подходили. В случае переноса гена между такими отдаленными группами организмов, как перенос гена животного в ядро или пластиду растения, необходимо поменять регуляторные последовательности и промоторы таким образом, чтобы они вообще могли запустить экспрессию этого гена, а еще лучше — чтобы они запустили ее именно в целевых ткани или органе, в данном случае в клубне.

В. При этом и в случае А, и в случае Б необходимо минимизировать риск того, что эти гены устойчивости «утекут» к близким родственникам вашего растения — например, к другим сортам этого вида на соседних участках и, тем более, к диким сородичам. Как вы можете это сделать?

Самый высокий риск «утечки генов» на соседние поля или вообще в дикую природу несет пыльца. Ее распространяют насекомые и/или ветер, и она запросто преодолевает километры. В меньшей степени опасность представляют семена (это очень зависит от растения, с которым вы работаете, — а что если это одуванчик?).

Если вы модифицируете ядерный геном, можно модифицировать гены, ответственные за развитие тычинок и пыльцы (пример см. в статье G. S. Rao et al., 2017. Evolvement of transgenic male-sterility and fertility-restoration system in rice for production of hybrid varieties). Разрабатываются и другие способы (см., например, J. Huang et al., 2016. Creating Completely Both Male and Female Sterile Plants by Specifically Ablating Microspore and Megaspore Mother Cells), которые делают стерильными и мужские, и женские растения. Даже если эти способы включают в себя синтез двуцепочечной РНК и запуск РНК-интерференции (известно, что двуцепочечная РНК, синтезированная в растении на основе генов насекомых, вредит насекомым), они не повлияют на фертильность животных — у нас-то нет пыльцы и завязей. А вот если вы модифицируете пластиды, проблема во многом решена сразу: они передаются только по материнской линии. Конечно, если вы можете контролировать распространение семян.

В конце 80-х годов специалисты японской биотехнологической компании Suntory решили создать розу невозможного синего или голубого цвета. Это решение стало началом пути, который длится уже тридцать лет.

Они стартовали практически с нуля — с поиска генов, которые синтезируют антоцианы, в растениях. К 90-м годам поиск увенчался успехом: удалось выделить эти гены из петунии. Статью об этом опубликовали в журнале Nature (см. T. Holton et al., 1993. Cloning and expression of cytochrome P450 genes controlling flower colour).

Обнаруженные гены синтеза дельфинидина из петунии вставили в геном розы. Трансформация прошла успешно. Но через год, когда розы зацвели, в их лепестках не было синего пигмента. Пигменты искали, выделяя их из растертых лепестков розы и разделяя с помощью хроматографии (собственный красный пигмент розы еще не заглушили).

Исследователи попробовали перенести в розу гены из горечавки и нескольких других синих растений. Снова не получилось. Переключились на гвоздику — там гены петунии заработали, и к 1997 году был создан сорт фиолетовых гвоздик Moonseries. И только когда в розы перенесли гены синтеза дельфинидина из анютиных глазок, в лепестках появились синие пигменты. В чем было дело — в разной силе РНК-интерференции по отношению к ДНК из разных растений, в разных промоторах, в разных регуляторных последовательностях или в разной частоте использования кодонов — история умалчивает. По крайней мере, пока.

Следующими шагами была генетическая модификация разных сортов роз (исследователи взяли около 40 разновидностей) и РНК-интерференция красного пигмента. При этом исследователи воздействовали на фермент дигидрофлавонол-4-редуктазу (Dihydroflavonol 4-reductase) — подавили экспрессию этого фермента у самой розы, но добавили копию из анютиных глазок: у этих растений она работает с другим субстратом и приводит к синтезу дельфинидина (Y. Katsumoto et al., 2007. Engineering of the Rose Flavonoid Biosynthetic Pathway Successfully Generated Blue-Hued Flowers Accumulating Delphinidin). Именно так была получена сиреневая роза, которую вы видели в условии задачи.

Есть хорошая новость: возможно, в ближайшее время мы всё-таки увидим генно-модифицированные розы с синими лепестками. В последнее время исследователи занялись химическими модификациями дельфинидина. Чтобы получить насыщенный синий цвет, надо либо изменить pH вакуоли, либо создавать комплексы антоцианов и других флавоноидов с металлами, либо гликозилировать антоцианы.

В 2017 году специалисты компании Suntory опубликовали статью о том, что им удалось сделать антоцианы в лепестках хризантемы устойчиво синими: кроме генов синтеза синих антоцианов колокольчиков (которые ближе к хризантемам, чем у петунии), они добавили фермент гликозилтрансферазу. Взаимодействие дегликозилированных антоцианов и желтых гликозидов флавоноидов дает синий цвет (N. Noda et al., 2017. Generation of blue chrysanthemums by anthocyanin B-ring hydroxylation and glucosylation and its coloration mechanism). Зайти с этой стороны кажется более резонным, чем менять рН вакуоли или нагружать растительную клетку металлами, — оба последних варианта могли бы сильно изменить физиологию растительной клетки.

Рис. 3. A — генетически модифицированные хризантемы (кроме первой). B–D — содержание в них производных цианидинов и дельфинидинов. G, H — спектры поглощения смеси пигментов, выделенных из каждой разновидности хризантемы. Изображение из статьи N. Noda et al., 2017. Generation of blue chrysanthemums by anthocyanin B-ring hydroxylation and glucosylation and its coloration mechanism

Как вы видите, исследователей, которые занимаются генетической модификацией растений, ожидает множество подводных камней. Особняком стоит генетическая модификация однодольных растений, к которым относятся злаки, пальмы, орхидеи, луковичные. Агробактерия не является естественным паразитом однодольных, поэтому надо либо использовать другие векторы, либо создавать особо заразные плазмиды. Однодольные растения гораздо хуже регенерируют, их сложнее выращивать в чашке Петри. И если модификацией злаков — кукурузы, риса, сахарного тростника — занялись уже давно и добились впечатляющих результатов, то, похоже, генно-модифицированных лилий синего цвета ждать еще долго.

Задача по созданию синей розы — а как вы теперь знаете, попутно были созданы еще и сиреневые гвоздики, и голубые хризантемы — выделяется среди других историй генетической модификации растений. Как правило, цель генетической модификации сугубо практическая — защита от гербицидов, вредителей и патогенов, улучшение вкуса и пищевой ценности растения, синтез какого-либо важного белка с возможностью потом выделить его из растительного сырья.

Но все перечисленные выше принципы работают и для этих задач. Иногда они получают необычное на первый взгляд решение. Например, один из способов защитить растение от насекомого-вредителя или от конкретного вируса — это перенести в него ген какого-нибудь очень важного белка этого вредителя или вирусного капсида. Зачем? Вы знаете ответ: чтобы запустить РНК-интерференцию против вируса, если он проник в клетку, — и РНК-интерференцию в организме насекомого, которое напало на растение (поэтому ген белка насекомого-вредителя модифицируют так, чтобы с него синтезировалась двухцепочечная РНК).

В последние годы стало гораздо доступнее полногеномное секвенирование, и поэтому набирает силу еще одно направление генетических модификаций — внесение точечных исправлений в собственный геном растения. А что если нужные гены у растения уже есть, и нужно их только починить? Например, перец чили ценят за жгучий вкус. Но у него невысокая урожайность. Вместо того чтобы выращивать перцы чили, было бы удобнее создать помидоры с жгучим вкусом и выращивать их — урожайность у них не в пример больше! Так вот, «сломанные» гены для синтеза капсаицинов есть у помидоров, и год назад ученые предложили их активировать (E. R. Naves et al., 2019. Capsaicinoids: Pungency beyond Capsicum).

Больше о генетически модифицированных растениях и о том, как их создают, читайте в статье В. В. Чуба «Растения-ГМО».