Мыши или собаки?

При проверке на культурах фибробластов (клеток соединительной ткани) собак и мышей выявленные различия могли сохраниться, а могли и исчезнуть или сильно уменьшиться. В зависимости от этого ответы на первую часть задачи (точнее, физиологическое объяснение) будут разными.

Кроме физиологического объяснения, возможны и другие. На каждое биологического явление можно посмотреть с нескольких точек зрения. Подумайте, как можно объяснить наш случай с точки зрения эволюции, физиологии и экологии и как это связано со второй частью вопроса.

Сначала обсудим первую часть задачи.

1. С чем это может быть связано?

Отчасти различия между мышами и собаками могут быть связаны с их экологией и эволюцией — в частности, с питанием. Мыши (Mus musculus) всеядны — они питаются в основном семенами, насекомыми (гусеницами, личинками жуков) и другими беспозвоночными. В зависимости от сезона и местообитания может преобладать либо растительная, либо животная пища. Собаки (Canis lupus) могут употреблять растительную пищу, но исходно всё-таки преимущественно хищные и питаются обычно позвоночными, среди которых ядовитых видов практически нет.

Легко представить себе, что среди пищевых объектов мыши есть ядовитые для собак растения или насекомые. Тогда устойчивость мышей к яду можно объяснить тем, что яд выделен из ее пищевого объекта — какого-то растения. А мыши в ходе эволюции приобрели устойчивость к этому яду. Можно предположить, что собаки будут более устойчивы к ядам бактерий, развивающимся в тухлом мясе.

Однако часто организмы по-разному реагируют и на яды, с которыми никогда раньше не сталкивались, — ксенобиотики. Причем иногда чувствительность разных видов млекопитающих к ксенобиотикам различается в сотни и даже в тысячи раз. Так, LD50 для тетрахлородибензо-р-диоксина (2,3,7,8-Tetrachlorodibenzodioxin) у хомячков — около 5 мг/кг, а у морских свинок — 1 мкг/кг, то есть примерно в 5000 раз меньше.

Наиболее вероятное объяснение этого с точки зрения физиологии — в том, что у мыши, собаки и других видов различаются наборы ферментов печени, участвующие в обезвреживании ядов. Наверное, многие из школьного курса физиологии человека помнят, что «печень обезвреживает яды». Но редко кто из учеников задает учителю вопрос: «А как?». На самом деле по-разному. Например, ферменты клеток печени могут просто расщепить яд, превратив его в нетоксичные «осколки». А могут, наоборот, синтезировать из него менее токсичное производное. Самый же важный механизм — превращение гидрофобного яда в гидрофильное производное (так называемый конъюгат). Тут уже не очень важно, ядовито это новое вещество или нет. Важно вывести его из клеток (в состав желчи или даже в кровь). Обратно внутрь клеток это соединение попасть уже не сможет (ведь сквозь липидный бислой клеточной мембраны гидрофильные молекулы не проникают, а для незнакомых веществ вроде лекарств транспортные белки в мембране вряд ли найдутся. И если мишень у яда внутриклеточная, то задача решена.

К сожалению, нередко печень работает по принципу «хотели как лучше, а получилось как всегда». При «обезвреживании» ксенобиотика образуются гораздо более токсичные вещества. Например, афлатоксин B₁ — сильный яд из плесневых грибов — превращается в печени в более ядовитое вещество у всех изученных видов млекопитающих и птиц. А вот способность к обезвреживанию этого производного вещества у разных видов различается. Поэтому чувствительность к афлатоксину у индеек, морских свинок и собак высокая, а у кур, мышей и овец низкая.

Вот почему на культурах фибробластов различия в чувствительности собак и мышей к лекарству могли и не обнаруживаться. Поскольку печень превращает ксенобиотики в новые вещества, причем разные у разных видов, при проверке лекарств на токсичность используют культуры клеток печени человека.

Другое правдоподобное объяснение — связь токсичности с различиями кишечной микрофлоры собак и мышей. Как и клетки печени, кишечные бактерии могут обезвреживать яды, а могут превращать безвредные вещества в ядовитые. Пожалуй, наиболее известный пример — превращение относительно безвредных нитратов в ядовитые нитриты кишечными бактериями человека. Микрофлора у млекопитающих разных отрядов может сильно различаться. Например, у мышей бактерии присутствуют почти во всех отделах пищеварительного тракта, а у собак и человека — преимущественно в толстом кишечнике. Эффекты лекарств могут различаться и из-за их воздействия на микрофлору. Например, у морских свинок пенициллин в виде таблеток в обычных дозах вызывает высокую смертность. Оказалось, что у них при этом бурно размножаются в кишечнике грамотрицательные бактерии, вызывая «суперинфекцию». У других млекопитающих пенициллин такого эффекта не вызывает (хотя осложнения, связанные с изменениями микрофлоры, вызывать может).

Различия в токсичности могут быть связаны и с разной всасываемостью лекарства. В свою очередь, она может зависеть от способа введения. Например, у более крупных видов меньше относительная площадь поверхности тела, да и кожа более толстая. Если ядовитое вещество всасывается через кожу, мыши почти наверняка окажутся к нему намного чувствительнее, чем собаки. У мыши массой 10 г на каждый грамм массы тела приходится примерно 2 см² кожи, а у собаки массой 10 кг — 0,2 см². Зато у крупных видов больше относительная поверхность легких; при ингаляции собака получит большую дозу лекарства (хотя и не в сто раз).

Вообще, от размеров у млекопитающих зависят многие параметры. Например, уровень основного обмена — затраты энергии на единицу массы тела — у мыши примерно в 10 раз выше, чем у собаки. А от уровня обмена может зависеть скорость расщепления лекарства или скорость его выведения из организма.

Но бывает, что различия в токсичности вещества не связаны ни с одним их перечисленных факторов. Так, стократные различия в токсичности колхицина для крыс и золотистых хомячков (см. послесловие) сохраняются в культуре фибробластов. Нередко вообще неизвестно, почему на одни виды вещество действует, а на другие — нет. А в тех случаях, когда это известно, иногда это явный результат случайных мутаций. Например, норбормид убивает крыс рода Rattus, но слабо ядовит для остальных млекопитающих. У крыс он открывает поры во внутренней мембране митохондрий, а к внутренней мембране его доставляет белок наружной мембраны, участвующий в транспорте холестерина, — периферический бензодиазепиновый рецептор. Замена одной аминокислоты в этом белке крыс сделала их чувствительными к яду.

Теперь — о второй части задачи.

2. Можно ли предсказать, какое из этих двух веществ будет более токсичным для человека? От чего это может зависеть?

Из последнего примера видно, что предсказать токсичность какого-то вещества для человека часто невозможно, даже если используется широкий круг видов-моделей (см. послесловие). Так что короткий ответ на второй вопрос — нельзя. И все-таки некоторые предсказания можно сделать — пусть выполняться они будут далеко не во всех случаях.

Более близкие родственники (при прочих равных), скорее всего, будут иметь большее сходство по всем признакам, в том числе и по чувствительности к ядам. С этой точки зрения мышь ближе к человеку — приматы и грызуны относятся к одному надотряду, Euarchontoglires, а хищные — к другому, Laurasiatheria (см. Molecular phylogenetics based family tree of placental mammals). В этом смысле мышь — более удачная модель человека, чем собака или свинья (копытные — близкие родственники хищных).

Сложнее оценить степень близости человека к мыши или собаке по характеру питания. С одной стороны, исходно высшие приматы — растительноядные, и наши далекие предки питались в основном растительной пищей. С другой стороны, предки человека перешли на преимущественно мясную диету уже довольно давно, около 2,5 миллионов лет назад (см. Саблезубые кошки помогли становлению человека, «Элементы», 15.09.2010). Питание трупами крупных животных тоже сближает наших предков с собаками. Из общих соображений можно предполагать, что в силу необычайной всеядности человек окажется столь же устойчивым ко многим растительным ядам, что и мышь, и столь же устойчивым ко многим бактериальным токсинам разлагающих мясо бактерий, что и собака.

По составу микрофлоры кишечника человек сильно отличается и от мышей, и от собак (да и разные люди заметно отличаются друг от друга — см., например, Кишечные бактерии помогают японцам переваривать водоросли, «Элементы», 08.04.2010). Но по распределению микрофлоры и ее роли в переваривании пищи мы все-таки ближе к собакам.

Наконец, по размерам и уровню основного обмена человек, конечно, намного ближе к собаке.

Рассуждая о связи устойчивости к ядам с питанием, мы исходили в основном из общих соображений. А как на самом деле — могут ли млекопитающие в ходе эволюции повысить устойчивость к ядам пищи в десятки или сотни раз? Оказывается, могут.

Замечательный пример такой видовой устойчивости — обнаруженная в 50-е годы XX века нечувствительность золотистых хомячков Mesocricetus auratus к колхицину — яду из растений рода Colchicum (безвременник). Этот яд использовали как лекарство при некоторых формах рака, а сейчас используют при подагре и других воспалительных процессах. Колхицин связывается с белком тубулином и препятствует сборке микротрубочек, из которых состоит, в частности, веретено деления клеток. Поэтому он подавляет деление клеток — увы, не только раковых, но и всех остальных. Кроме того, колхицин подавляет подвижность и активность нейтрофилов (на этом основано его противовоспалительное действие). Тубулин — очень консервативный белок. И можно предполагать, что колхицин будет одинаково ядовит для всех клеток. В целом это так и есть. Но золотистые хомячки оказались исключением — они спокойно питались семенами безвременника и выживали при дозах колхицина, в 100 и более раз превышающих LD50 для крыс и мышей. Про жизнь золотистых хомячков в природе известно очень мало. Можно только предполагать, что в пустынях Сирии, Израиля и Турции, где они обитают (или обитали еще недавно), безвременник был одним из важных компонентов их пищи.

(Замечательно, что тубулин хомячков столь же чувствителен к колхицину, что и у других видов. В то же время печень хомячка обезвреживает колхицин лишь в 3–4 раза активнее, чем у мышей и крыс. Устойчивость его клеток объясняется меньшей проницаемостью мембран для колхицина и, возможно, его более активным выведением из клетки.)

В целом устойчивость к ядам пищевых объектов достаточно широко распространена среди млекопитающих и других животных. Например, кузнечиковые хомяки (тоже пустынные, но в отличие от золотистых хомячков — хищные грызуны) нападают на скорпионов и едят их. Скорпионы часто их при этом жалят. Но смертельная для обычных мышей доза яда не опасна для хомяков такого же размера: их устойчивость к яду скорпионов выше в 20–30 раз (A. Rowe, M. Rowe, 2008. Physiological resistance of grasshopper mice (Onychomys spp.) to Arizona bark scorpion (Centruroides exilicauda) venom). К тому же они еще и «научились» не чувствовать боли от укола скорпиона, очень болезненного для других животных (A. Rowe et al., 2013. Voltage-Gated Sodium Channel in Grasshopper Mice Defends Against Bark Scorpion Toxin). Другой похожий случай описан в заметке на «Элементах» (Неядовитые змеи вырабатывают устойчивость к смертоносному яду тритонов, 21.03.2008). Только тут речь идет уже о внутривидовой изменчивости. Устойчивость подвязочных змей Thamnophis sirtalis к тетродотоксину, содержащемуся в коже их жертв (желтобрюхих тритонов), различается в разных популяциях этого вида в 50 раз.

Конечно, разная устойчивость к яду (или лекарству, что, в общем-то, одно и то же) может быть никак не связана ни с экологией, ни с эволюцией вида, ни даже с физиологией. Как уже упоминалось, она может возникать просто из-за случайных мутаций. И не только у разных видов, но и у отдельных особей и даже у отдельных клеток в пределах организма. Хорошо известно, что клетки раковых опухолей одного типа могут отличаться друг от друга (и от нормальных клеток) по устойчивости к лекарствам более чем в сто раз. Такая «множественная лекарственная устойчивость» (часто клетки теряют чувствительность сразу ко многим препаратам) — одна из серьезных проблем, возникающих при химиотерапии рака. Еще чаще повышенная устойчивость к лекарствам возникает у бактерий (см. Устойчивость к противомикробным препаратам).

Известно, что повышенная устойчивость к конкретному лекарству может достигаться разными способами (Механизмы резистентности микроорганизмов). Часто клетки усиленно выводят лекарство наружу с помощью белков-насосов. Иногда (как в случае с золотистыми хомячками) понижается проницаемость мембраны клеток. Нередко клетки находят способ обезвреживать лекарство, разлагая или модифицируя его молекулы. Может меняться внутриклеточная мишень, так что лекарство уже не действует на нее.

Рис.1. Защитники животных активно пропагандируют запрет на эксперименты над ними, в том числе с целью испытаний лекарственных препаратов. Рис. с сайта humaneresearch.org.au

Так что же, если ничего нельзя в точности предсказать, проводя опыты на животных, получается, что ученые зря их мучают? К сожалению, подобная точка зрения так широко распространена, что движения в защиту прав животных становятся во многих странах реальной проблемой для научных исследований. (Когда мой отец работал в Ратгерском университете, он обратил внимание, что кнопка верхнего этажа в лифте не нажимается — она защищена кодом. Он спросил местного сотрудника, что там находится. Оказалось — виварий. И не в последнюю очередь он был на верхнем закрытом этаже из-за постоянных попыток активистов выпустить на волю «бедных животных». И даже при таких мерах университет решил избавиться от обезьян — иначе активисты уж совсем не давали жизни...)

К некоторому своему изумлению, при подготовке задачи я столкнулся с пропагандой этой точки зрения не только на многочисленных сайтах в интернете, но и в научных статьях — правда, не в биологических журналах. Характерный пример — вот эта статья со списком литературы из 200 названий, анализирующая трагедию с талидомидом. Это лекарство, рекламировавшееся как снотворное и антидепрессант без побочных эффектов, вызвало тяжелые врожденные уродства почти у десяти тысяч детей. После этого требования к испытаниям лекарств сильно ужесточились. В частности, в обязательном порядке их испытывают на тератогенность — способность вызывать уродства у потомства при приеме во время беременности. Тут, естественно, нельзя заменить животных культурой клеток.

Оказывается, именно история с талидомидом для защитников животных — довод в пользу того, что опыты на животных при испытаниях лекарств проводить бессмысленно!

Никто точно не знает, испытывали ли талидомид до выпуска в продажу на беременных мышах или крысах. Однако в дальнейшем выяснилось, что у многих видов он не вызывает врожденных уродств. К высоким дозам талидомида устойчивы крысы, мыши и большинство других грызунов (кроме белых новозеландских кроликов), а также многие другие млекопитающие. Однако он вызывает уродства у куриных эмбрионов, а также практически у всех исследованных видов приматов.

Рис. 2. Не всегда можно предсказать неблагоприятные воздействия лекарств на человека, испытав его на одном виде подопытных животных

То есть если бы лекарства испытывали не только на мышах, но и на обезьянах, трагедии с талидомидом можно было бы избежать. «Ну и что, — возражают сторонники гуманности по отношению к животным, — ведь всегда найдется какой-то вид, у которого безвредное для человека лекарство будет вызывать врожденные уродства. Что же теперь, вообще не выпускать новых лекарств? А вредное лекарство может оказаться вредным только для человека!»

Логика тут, конечно, сильно хромает (подумайте, почему). Кроме того, методы экспериментирования с животными тоже не стоят на месте.

Сильно усовершенствовались методы получения нокаутных и трансгенных мышей. Для этого в последние десятилетия разработаны методики, позволяющие отключить любой ген в определенной ткани или органе (см., например, про современные возможности метода Cre-Lox рекомбинации: The ABC’s of choosing a Cre strain to generate KO mice).

Рис. 3. Методы получения генетически модифицированных животных постоянно усовершенствуются. Рисунок с сайта mouseclique.jax.org

Можно активировать гены и направленно изменять их последовательности (см. про методы редактирования генома: I. Maggio & M. Gonçalves, 2015. Genome editing at the crossroads of delivery, specificity, and fidelity). Можно также заменять у мышей отдельные мышиные гены на человеческие. Кроме того, можно получать мышей с человеческими клетками и тканями (см., например, R. Ito et al., 2015. Current advances in humanized mouse models).

Рис. 4. «Гуманизированные» мыши — более адекватные модели для изучения многих болезней человека, чем обычные. Рисунок с сайта ashkarlab.com

Понятно, что такие «гуманизированные» мыши позволяют более точно предсказать воздействие разных веществ и патогенов на человеческий организм. Но об этом в статьях про «бесполезность» испытаний лекарств на животных почему-то обычно не пишут.