Бактерия с синтетическим минимальным геномом сохранила способность к адаптивной эволюции

Рис. 1. Бактерии с синтетическим неминимальным геномом (901 ген, справа вверху, голубые значки на графике) в ходе эволюционного эксперимента заметно увеличились в размерах, а бактерии с минимальным геномом (493 гена, справа внизу, розовые значки) остались мелкими. Длина масштабного отрезка — 1 мкм. Изображение из обсуждаемой статьи в Nature

В 2016 году американские биологи создали бактерию с синтетическим минимальным геномом, содержащим всего 493 гена — меньше, чем у любого другого организма, способного самостоятельно расти в лабораторных условиях. Ожидалось, что удаление всех генов, кроме абсолютно необходимых для выживания, может сделать бактерий неспособными к адаптивной эволюции. Однако эволюционный эксперимент, поставленный для проверки этой гипотезы, не подтвердил ее. Оказалось, что «минимизированные» бактерии сохранили эволюционный потенциал. Их приспособленность (оцениваемая по скорости размножения) в ходе эксперимента росла даже быстрее, чем у исходных, неминимизированных бактерий, у которых в геноме 901 ген. Изначально минимизация вдвое снизила скорость размножения, но за 2000 поколений бактерии вернулись к исходному уровню приспособленности. Исследование показало, что искусственно спроектированные упрощенные организмы могут быть оптимизированы эволюционными методами, что открывает новые горизонты перед синтетической биологией.

Американские биологи из института Крейга Вентера (J. Craig Venter Institute) и их коллеги из других научных учреждений продолжают двигаться к заветной цели: созданию искусственных организмов с желаемыми свойствами. Важнейшие вехи этого пути освещались на «Элементах» (см. ссылки в конце новости). В новой статье, опубликованной в июле в журнале Nature, исследователи сообщили о результатах экспериментов, призванных прояснить вопрос о том, как удаление из генома всего «лишнего» (того, без чего можно худо-бедно обойтись в идеальных условиях) сказывается на эволюционном потенциале организмов.

Работа велась с двумя штаммами бактерий-микоплазм с синтетическими геномами. Первый из них — «неминимальный» штамм syn1.0, о котором рассказано в новости Создано первое живое существо с синтетическим геномом («Элементы», 25.05.2010). Геном syn1.0 содержит 901 ген и представляет собой слегка модифицированную синтетическую копию генома природной бактерии Mycoplasma mycoides, возбудителя пневмонии коров.

Геном второго, «минимального» штамма syn3B был сконструирован из генома syn1.0 путем максимального сокращения. Из генома убрали всё, что можно было убрать, сохранив бактериям жизнеспособность и приемлемую для лабораторных экспериментов скорость размножения (см.: Изготовлена бактерия с синтетическим минимальным геномом, «Элементы», 28.03.2016). У syn3B всего 493 гена, из которых 474 абсолютно необходимы для выживания, а 19 были оставлены для сохранения достаточной скорости роста лабораторной культуры. Это меньше, чем у любого другого организма, способного расти на искусственной среде самостоятельно, то есть в отсутствие других микробов.

Исследование состояло из двух этапов. Их целью было выяснить, как повлияло радикальное сокращение генома, во-первых, на мутагенез, во-вторых, на способность к адаптивной эволюции под действием отбора.

Чтобы оценить мутагенез, был проведен «эксперимент по накоплению мутаций» (mutation accumulation experiment). Бактерий syn1.0 и syn3B высевали на плотную питательную среду, брали одну из выросших колоний, разбавляли ее, снова высевали, опять брали одну случайную колонию и так далее. Поскольку каждая колония происходит от одной родительской клетки, подобная процедура ведет к регулярному сокращению численности популяции до одной бактерии. В таких условиях влияние естественного отбора на количество и спектр накапливающихся мутаций сводится к минимуму. Хотя, конечно, мутации с сильным отрицательным эффектом (летальные и очень вредные) продолжают отбраковываться. Но все же в итоге появляется возможность увидеть результаты мутагенеза если не в чистом виде, то в каком-то разумном приближении к нему. Стоит упомянуть, что один из авторов статьи — Майкл Линч (Michael Lynch), крупнейший специалист как раз по измерению темпов мутагенеза у прокариот.

Результаты оказались неожиданными. У ученых были основания предполагать, что «минимальные» микоплазмы syn3B будут мутировать быстрее, чем неминимальные syn1.0. Хотя бы потому, что у syn3B удалены два гена, участвующие в репликации, и восемь генов, связанных с репарацией. Казалось бы, точность копирования генетического материала должна была от этого пострадать.

Ожидания не подтвердились. Темп мутагенеза у обоих штаммов оказался, во-первых, одинаковым, во-вторых, рекордно высоким: чуть более 3·10⁻⁸ мутаций на нуклеотид за поколение (рис. 2).

Рис. 2. Темп мутагенеза (число нуклеотидных замен на нуклеотид за поколение, по вертикальной оси) у разных организмов в зависимости от размера генома (по горизонтальной оси). Синие точки — бактерии, зеленые — одноклеточные эукариоты, красные — многоклеточные эукариоты. Микоплазмы с синтетическим минимальным геномом (syn3B) показаны синим крестиком, микоплазмы с синтетическим неминимальным геномом (syn1.0) — синей звездочкой. Видно, что они вписываются в характерную для одноклеточных закономерность: чем меньше геном, тем выше темп мутагенеза. Числами обозначены виды: 1 — Apis mellifera; 2 — Arabidopsis thaliana; 3 — Caenorhabditis briggsae; 4 — Caenorhabditis elegans; 5 — Daphnia pulex; 6 — Drosophila melanogaster; 7 — Heliconius melpomene; 8 — Homo sapiens; 9 — Mus musculus; 10 — Oryza sativa; 11 — Pan troglodytes; 12 — Pristionchus pacificus; 13 — Chlamydomonas reinhardtii; 15 — Paramecium tetraurelia; 17 — Saccharomyces cerevisiae; 18 — Schizosaccharomyces pombe; 20 — Agrobacterium tumefaciens; 21 — Bacillus subtilis; 22 — Burkholderia cenocepacia; 23 — Deinococcus radiodurans; 24 — Escherichia coli; 26 — Mesoplasma florum; 27 — Mycobacterium smegmatis; 29 — Pseudomonas aeruginosa; 32 — Staphylococcus epidermidis; 34 — Vibrio cholera; 35 — Vibrio fischeri. Данные из обсуждаемой статьи в Nature добавлены на рисунок из статьи M. Lynch et al., 2016. Genetic drift, selection and the evolution of the mutation rate

Высокий темп мутагенеза, возможно, объясняется тем, что он характерен и для исходной, природной бактерии Mycoplasma mycoides. Это согласуется с общей закономерностью, характерной для одноклеточных: как правило, чем меньше размер генома, тем выше темп мутирования в расчете на нуклеотид за поколение, а у микоплазм маленькие геномы. Это, в свою очередь, может объясняться тем, что оба признака — маленький геном и высокий темп мутирования — коррелируют с низкой эффективной численностью популяции (Ne). При низкой Ne эффективность естественного отбора снижается, а дрейф усиливается. Поэтому отбору труднее доводить функции до совершенства (в том числе такую функцию, как контроль точности репликации), а полезные, но не жизненно необходимые гены с большей вероятностью могут быть потеряны (отсюда — уменьшение генома). Судя по косвенным признакам (таким как низкое процентное содержание нуклеотидов C и G) для M. mycoides характерна низкая Ne. Всё это согласуется с поддерживаемой Майклом Линчем гипотезой о том, что эволюция темпа мутагенеза определяется так называемым «порогом дрейфа» (подробнее эти идеи разбираются в новости У позвоночных скорость мутирования и численность популяции связаны отрицательной корреляцией, «Элементы», 13.03.2023). Пожалуй, к этому стоит добавить, что чем меньше геном, тем более высокий темп мутагенеза в расчете на нуклеотид могут себе позволить организмы, не рискуя вымереть от перегруженности вредными мутациями (риск вырождения зависит от темпа мутагенеза в расчете на геном, а не на нуклеотид).

Но почему у «минимальных» бактерий syn3B мутагенез не ускорился по сравнению с syn1.0, несмотря на удаление многих генов, помогающих точно копировать ДНК? Это осталось неясным. Одно из возможных объяснений состоит в том, что на самом деле мутагенез у syn3B все-таки ускорился, но это не удалось заметить, потому что из-за предельного сокращения генома случайно возникающие мутации чаще оказываются летальными, а летальные мутации использованными методами обнаружить нельзя.

Количественное соотношение разных типов мутаций (вставок, делеций и однонуклеотидных замен) тоже оказалось одинаковым у syn3B и syn1.0. В обоих случаях замены составляют подавляющее большинство обнаруженных мутаций. Но вот по соотношению разных типов замен нашлось различие: у «минимальных» микоплазм syn3B цитозин (С) чаще превращается в тимин (T), чем у неминимальных syn1.0. Скорее всего, это связано с утратой гена ung, белковый продукт которого вырезает из ДНК урацилы (U). Один из важных источников новых мутаций — спонтанное превращение C в U. В ходе репликации U интерпретируется клеткой как T, что в итоге приводит к замене комплементарной пары C:G на T:A. Ген ung защищает клетку от таких мутаций.

Чтобы оценить эволюционный потенциал бактерий syn3B и syn1.0, ученые провели 300-дневный эволюционный эксперимент, в ходе которого сменилось примерно 2000 поколений бактерий. В отличие от эксперимента по накоплению мутаций, на этот раз были созданы условия, максимизирующие эффективность отбора и минимизирующие дрейф. Соотношение эффективности отбора и дрейфа зависит прежде всего от численности популяции. Микоплазмы жили в жидкой питательной среде. Раз в сутки 3 мл среды с бактериями переносили в пробирку со свежей средой. При этом численность популяции всегда оставалась высокой — пересаживалось не менее 20 млн клеток. В эксперименте участвовали четыре исходно одинаковые популяции syn1.0 и столько же популяций syn3B.

Главным измеряемым показателем была дарвиновская приспособленность, которую, как принято в таких экспериментах, оценивали по скорости роста бактериальной культуры по сравнению с исходным, предковым штаммом syn1.0.

Поскольку в геноме syn3B осталось очень мало избыточности, а почти все гены являются жизненно необходимыми, можно было ожидать, что почти все мутации будут снижать приспособленность, так что положительному отбору не за что будет зацепиться. С этим согласуется хорошо известный факт, состоящий в том, что жизненно важные гены (essential genes), как правило, эволюционируют медленнее тех, чья утрата в идеальных условиях не смертельна (non-essential genes). Кроме того, уменьшение генома само по себе должно было сократить число позиций, на которые потенциально может воздействовать положительный отбор. Поэтому логично было предположить, что эволюционный потенциал (понимаемый в данном случае как способность наращивать приспособленность под действием отбора) будет намного меньше у syn3B, чем у syn1.0. С другой стороны, радикальное сокращение генома могло нарушить его связность и работоспособность, изменив структуру межбелковых взаимодействий, так что какие-то клеточные функции стали выполняться менее оптимальными путями. Тогда, наоборот, у отбора может оказаться больше возможностей для оптимизации разлаженного организма (см. Принцип Анны Карениной). Какой из факторов перевесит, заранее сказать было нелегко. Что же показал эксперимент?

Эксперимент показал, что сокращение генома не лишило syn3B способности к быстрой адаптивной эволюции. Изначально у syn3B приспособленность к данным условиям культивирования была вдвое ниже, чем у syn1.0. Иначе говоря, после удаления половины генов бактерии стали размножаться вдвое медленнее. В ходе эволюционного эксперимента приспособленность syn3B стала быстро расти. К концу эксперимента, то есть по прошествии 2000 поколений, приспособленность syn3B вернулась на исходный уровень (рис. 3). Иными словами, проэволюционировавшие микоплазмы с минимальным геномом размножаются так же быстро, как и предковый штамм с вдвое большим по размеру геномом. Адаптивная эволюция за 300 дней полностью скомпенсировала ущерб, принесенный минимизацией генома.

Рис. 3. Рост приспособленности минимальных и неминимальных микоплазм (соответственно, красные и синие значки) в ходе эволюционного эксперимента. По вертикальной оси — скорость размножения по сравнению с исходными неминимальными бактериями syn1.0. Ancestor — состояние в начале эксперимента, Evolved — по его завершении. Кружочки — повторности (в эксперименте участвовало по четыре популяции каждого из двух типов). Рисунок из обсуждаемой статьи в Nature

Неминимальные микоплазмы syn1.0 тоже повысили свою приспособленность в ходе эксперимента. Спустя 2000 поколений syn1.0 размножались по-прежнему быстрее, чем syn3B, но разрыв между ними сократился, потому что приспособленность минимальных бактерий росла быстрее. Из этого, впрочем, не следует, что минимизация генома на самом деле увеличила эволюционные возможности микоплазм. Это всё тот же «принцип Анны Карениной»: улучшать плохое обычно проще, чем хорошее (в разлаженном геноме вероятность того, что случайная мутация окажется полезной, выше, чем в нормальном геноме, оптимизированном миллионами лет отбора).

Авторы изучили геномы проэволюционировавших бактерий, чтобы выяснить, какие гены изменились в ходе адаптации. То, что ген находился под действием положительного отбора, можно понять, в частности, по повышенной доле значимых (несинонимичных) нуклеотидных замен (см. Ka/Ks ratio). Оказалось, что адаптация syn1.0 и syn3B шла разными путями.

В четырех популяциях syn1.0 явные следы положительного отбора были обнаружены в 16 генах. Два из них участвуют в базовом метаболизме, пять — в работе с генетическим материалом (репликация, транскрипция, модификации ДНК и т. п.), три — в транспорте веществ через клеточную мембрану, четыре гена кодируют белки с неизвестными функциями. Жизненно необходимые гены (те, которые есть также у syn3B) эволюционировали не быстрее и не медленнее остальных (тех, которых нет у syn3B).

В четырех популяциях syn3B активнее всего эволюционировали 14 генов, причем только два из — те же, что подвергались положительному отбору у syn1.0. Среди этих 14 генов в базовом метаболизме задействованы два, в работе с генетическим материалом — три, в мембранном транспорте — один, генов с неизвестными функциями — один, и еще три гена участвуют в биосинтезе липидов. Из этого авторы делают вывод, что адаптация минимальных клеток пошла не по пути совершенствования мембранного транспорта (чтобы лучше закачивать дефицитные вещества из окружающей среды), а скорее по пути улучшения способностей к синтезу недостающих веществ.

Только два гена активно эволюционировали и у минимальных, и у неминимальных микоплазм. Один из них, ftsZ, кодирует белок, родственный эукариотическому тубулину и играющий важную роль в клеточном делении у прокариот. У восьми подопытных популяций в гене ftsZ закрепились разные мутации, однако у них есть кое-что общее. Большинство мутаций нарушает структуру того конца белковой молекулы ftsZ, которым она прикрепляется к клеточной мембране в ходе деления клетки.

Такие изменения ftsZ в принципе могут влиять на размер клеток (например, может измениться типичный размер, при котором клетка приступает к делению). В ходе эволюционного эксперимента размер клеток действительно изменился, правда, не во всех подопытных линиях, а только у неминимальных микоплазм syn1.0 (рис. 1). Средний диаметр клеток syn1.0 увеличился на 85% (от 439 до 811 нм).

Исследователи решили проверить, связано ли это с мутациями ftsZ. Для этого они вставили типичную мутацию, закрепившуюся в нескольких подопытных линиях — преждевременный стоп-кодон, лишающий белковую молекулу концевого участка, — в геномы исходных (неэволюционировавших) микоплазм syn1.0 и syn3B. Результат оказался довольно удивительным. У неминимальных бактерий syn1.0 мутация увеличила диаметр клеток на 25%, а у минимальных syn3B та же самая мутация уменьшила клеточный диаметр на 19%. Этот яркий пример эпистаза (зависимости фенотипического проявления мутации от генетического контекста) согласуется с предположением о том, что минимизация генома сильно изменила структуру молекулярных взаимодействий, определяющих жизнь клетки. «Минимальные» клетки syn3B — это не просто упрощенные копии syn1.0, а другие существа с другой системой внутренних взаимосвязей.

Но самый важный результат, конечно, состоит в том, что минимизация генома не лишила бактерий способности к быстрой эволюции. Это позволяет надеяться, что конструирование радикально упрощенных (и потому потенциально более понятных и просчитываемых) модельных организмов — с перспективой в будущем создать на их основе какие-то полезные для человека формы жизни — не тупиковый путь. Исследование показало, что даже крайне упрощенный организм, каким бы он ни был ущербным поначалу, может сохранить способность к адаптивной дарвиновской эволюции. Его можно оптимизировать путем селекции, восстановить исходную жизнестойкость — и двигаться дальше.

Источник: R. Z. Moger-Reischer, J. I. Glass, K. S. Wise, L. Sun, D. M. C. Bittencourt, B. K. Lehmkuhl, D. R. Schoolmaster Jr, M. Lynch & J. T. Lennon. Evolution of a minimal cell // Nature. 2023. DOI: 10.1038/s41586-023-06288-x.

См. также:
1) Изготовлена бактерия с синтетическим минимальным геномом, «Элементы», 28.03.2016.
2) Создано первое живое существо с синтетическим геномом, «Элементы», 25.05.2010.
3) Первая в мире операция по пересадке генома позволила превратить один вид бактерий в другой, «Элементы», 02.07.2007.

Александр Марков