Приобретенный иммунитет у бактерий может быть связан с механизмами РНК-интерференции

Устройство бактериофагов относительно единообразно — существенно более разнообразны отношения между фагами и бактериями. Они представляют целый спектр: от комменсализма до убийственного паразитизма. И каждый тип отношений оформляется особыми биохимическими средствами. Фото с сайта mansfield.osu.edu

Европейские ученые расшифровали один из этапов работы иммунной системы CRISPR у бактерий. Хотя эта система и широко распространена среди бактерий и архей, ее компоненты во многих случаях оказывались высокоспецифичными. Кроме того, ферменты, участвующие в оформлении иммунного ответа, были никак не связаны с другими участками бактериального метаболизма. Теперь ученые показали, что на одном из необходимых этапов работы CRISPR бактерии используют, во-первых, универсальный фермент РНКазу, а во-вторых, распространенный у эукариот механизм подготовки иммунного ответа, схожий с РНК-интерференцией. Таким образом, появилась возможность более содержательно интерпретировать происхождение и эволюцию иммунитета у бактерий.

Ученые всё основательнее погружаются в микро- или даже наножизнь, открывая всё новые механизмы ее функционирования. Каждый раз, обдумывая обсуждаемое исследование, не перестаешь удивляться полноте, многообразию и упорядоченности устройства жизни на том, недоступном обыденному восприятию, уровне. Между тем задачи, стоящие перед организмами любого масштабного уровня, более или менее общие — разнится лишь инструментарий.

Иногда для выполнения той или иной задачи используется универсальный набор инструментов, которыми владеют самые разные клетки или которые годятся для многих задач. Но чаще используется строго специфический набор для конкретной задачи. На уровне клеточных задач в качестве инструментов используются различные метаболические пути и связанные с ними ферменты. Нахождение универсальных клеточных инструментов всегда большая удача. Если таковые находятся, то можно рассуждать об их происхождении и эволюции, о важности решаемых с их помощью задач и т. д. Если же инструмент специфичный и нацелен на конкретную функцию у конкретной клетки, о его происхождении трудно заключить нечто определенное.

Новое исследование, представленное европейскими биохимиками из университетов Умео (Швеция), Вены (Австрия) и Вюрцбурга (Германия), связано с обсуждением именно таких универсальных инструментов клетки. Исследование посвящено расшифровке работы CRISPR-системы, которая призвана обеспечивать защиту от инфекции.

CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats ) — это особые участки геномов бактерий и архей, занятые защитой от вирусных и плазмидных атак и выработкой иммунитета. «Элементы» уже обращались к этой теме (см. Бактерии наследуют приобретенный иммунитет, 21.01.2010), поэтому лишь кратко суммируем базовые положения. CRISPR-кассета представляет собой участок генома, на котором помещаются, во-первых, короткие палиндромные последовательности, во-вторых, кусочки последовательности вирусной ДНК/РНК, так называемые спейсеры, в-третьих — серия специфических белков-нуклеаз, именуемых «Cas-белки» (CRISPR associated proteins). Спейсеры и палиндромы строго чередуются, и эта цепочка, собственно, и называется CRISPR.

При проникновении вируса в клетку участок его ДНК/РНК копируется и вставляется в геном бактерии. Вставка этого нового спейсера происходит при участии Cas-белков. Потомки такой клетки будут нести в своем геноме данный вирусный спейсер. Участок генома, несущий вставленный спейсер, будет нормально считываться и производить в конечном итоге короткие РНК, включающие палиндром и этот спейсер. Если вирус снова попадет в клетку, то с помощью полученной короткой РНК произойдет распознавание чужеродного комплементарного фрагмента ДНК (или РНК), и клетка уничтожит нуклеотидную цепочку паразита. Последовательность CRISPR постоянно достраивается по мере инфицирования новыми вирусами, а спейсеры, которые долгое время не использовались, мутируют, выходят из употребления и исчезают из цепочки. Это своего рода динамичная система приобретенного иммунитета, останавливающая инфекцию на уровне транскрипции и, таким образом, обеспечивающая устойчивость клеток к вирусным инфекциям.

Сама задача, которую решает система CRISPR, — универсальна, а схема ее решения логически четкая, поэтому, казалось бы, и инструменты для ее выполнения должны быть более или менее единообразными у прокариот. Но в действительности ученые пока не могут похвастаться расшифровкой базовых принципов работы CRISPR. Так, лекция Ирены Артамоновой, посвященная CRISPR, была названа «Адаптивный иммунитет прокариот, основанный на crispr-системах: много вопросов и мало ответов». Один из важных вопросов связан с филогенией Cas-белков. Считается, что они обслуживают все операции и приобретения новых спейсеров и их успешное функционирование. Число Cas-белков в кассете очень различается у разных бактерий и архей: оно варьирует от 20 до 4. Они могут быть сходными по составу у разных семейств бактерий, а у других бактерий различаться даже в пределах одного штамма. Это говорит о том, что никакие из белков Cas или их отдельные домены не могут претендовать на звание универсального инструмента CRISPR-иммунитета. Возможно, никакого универсального инструмента и нет, и бактерии каждый раз изобретают нечто, подходящее случаю. Но также возможно, что искать следует другим способом и в другом месте.

Европейская команда исследовала CRISPR систему у бактерии Streptococcus pyogenes. У этой бактерии два CRISPR-комплекта, один из которых находится, по-видимому, в нерабочем состоянии. Рабочий, судя по последовательностям спейсеров, направлен на защиту от лизогенных (умеренных) фагов. В рабочей кассете помимо палиндромов и спейсеров имеются еще 4 гена Cas-белков. Все они вовлечены только в процесс работы CRISPR. Первичное считывание приводит к появлению цепочек РНК из 511 нуклеотидов. Это так называемый предшественник crispr-РНК, который именуется pre-crРНК. Потом эта длинная РНК нарезается на нужные фрагменты «палиндром—спейсер», так называемые crРНК, которые, собственно, и занимаются распознаванием фаговых последовательностей. Иными словами, происходит процесс созревания — превращение первичного транскрипта в рабочие фрагменты crРНК.

Механизм РНК-интерференции: двухцепочечная РНК распознается эндонуклеазой Dicer и разрезается на короткие 25-нуклеотидные фрагменты siRNA. Антисмысловая цепочка присоединяется к комплексу RISC, и они вместе находят комплементарную мРНК. Опознанная таким образом мРНК разрезается на куски и деградирует. Схема с сайта nobelprize.org

Однако, как выяснилось, при считывании pre-crРНК с CRISPR-кассеты появляется еще одна короткая РНК, прежде неизвестная участница CRISPR иммунитета. Ее последовательность расположена на противоположной цепочке ДНК немного впереди самой кассеты. Эта РНК в ходе созревания тоже нарезается определенным образом. Ученые назвали ее буквально «супротив-активируемая crРНК» (trans-activating CRISPR RNA или, коротко, tracrRNA). Она и стала главной героиней их научного сюжета.

Основная особенность обнаруженной tracrRNA — это наличие участка из 25 нуклеотидов, который комплементарен всем палиндромным повторам CRISPR. Это означает, что tracrRNA связываются с повторами, и этот процесс зачем-то необходим для образования рабочих crРНК. Подтвердить эту гипотезу удалось, создав бактерий, мутантных в области tracrRNA. У таких бактерий созревания crРНК не происходило. Если же к таким ущербным бактериям добавить нормальную tracrRNA, то процесс созревания возобновлялся, продуцируя нормальные crРНК. Очевидно, что tracrRNA, спариваясь с палиндромами, образует двухцепочечные фрагменты РНК, концы которой так или иначе определяют границы будущих crРНК.

И тут, естественно, нельзя не вспомнить, как происходит процесс РНК-интерференции у эукариот. Двухцепочечная вирусная РНК опознается ферментом Dicer, разрезается на фрагменты из 25 нуклеотидов, двойная цепь фрагмента расплетается на одноцепочечные РНК. Затем одна из нитей — антисмысловая siРНК (siRNA) — прикрепляется к комплексу RISC. Эта конструкция находит чужеродные матричные РНК с участком, комплементарным ведущей siРНК. Спаривание двух нитей активизирует фермент, разрезающий чужеродную матричную РНК на куски. Фермент Dicer опознает только двухцепочечные РНК, и хотя РНК вирусов может состоять и из одной цепочки, всё равно в их жизненном цикле обязательно имеется двухцепочечная фаза.

В нашей CRISPR-системе тоже организуется двухцепочечная РНК из 24 нуклеотидов, но за счет наложения tracrRNA, которая имеется у запасливых Streptococcus pyogenes. Затем этот двухцепочечный комплект должен быть опознан эндонуклеазой. Фермента Dicer у бактерий нет — что же служит его бактериальным аналогом? Оказалось, что его роль выполняет бактериальная РНКаза III. Помогает ей один из Cas-белков — белок Csn1. Он заякоривает tracrRNA на длинной pre-crРНК, позволяя эндонуклеазе включиться в работу. РНКаза III весьма консервативна, не имеет специфической связи с CRISPR-системой и участвует во многих процессах, в частности обеспечивает созревание рибосомальной РНК. Здесь же этот фермент включился в оборонные мероприятия против фагов. Так что черты универсального инструмента, возможно, следует искать не среди Cas-белков, а анализируя общие черты РНК интерференции и CRISPR защиты, а также среди прочих инструментов для работы с РНК.

Схема участия необходимых компонентов в работе CRISPR. Сначала считывается предшественник pre-crRNA (верхняя линия: черные — повторы, зеленые — спейсеры); вместе с ним считываются c противоположной нити tracrRNA. К месту событий подтягивается РНКаза III и Csn1. Csn1 способствует спариванию tracrRNA с повторами CRISPR, затем РНКаза III узнает короткие двухцепочечные фрагменты и разрезает в конкретном месте двухцепочечный комплекс на фрагменты «повтор—спейсер—повтор». На второй ступени созревания создаются рабочие фрагменты crРНК из 39–42 нуклеотидов; механизм этой второй ступени пока неизвестен, поэтому на схеме стоят вопросы. Схема из обсуждаемой статьи в Nature

Таким образом, для успешной подготовки иммунной защиты бактерии необходимы tracrRNA, РНКаза III и Csn1. Два из них — tracrRNA и Csn1 — относятся к CRISPR системе, а один — неспецифический фермент для работы с РНК. tracrRNA вместе с Csn1 нашлись еще у пяти видов бактерий, но пока из-за недостатка данных трудно определить их реальную распространенность среди бактерий.

Источник: Elitza Deltcheva, Krzysztof Chylinski, Cynthia M. Sharma, Karine Gonzales, Yanjie Chao, Zaid A. Pirzada, Maria R. Eckert, Jörg Vogel, Emmanuelle Charpentier. CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III // Nature. 2011. V. 471, P. 602–607.

Елена Наймарк