«Т-клеточный иммунитет гораздо лучше защищен от мутаций вируса, чем гуморальный»

Интервью Надежды Маркиной с Григорием Ефимовым
«Природа» №5, 2021

В ответ на коронавирусную инфекцию, как и на любую другую, наш организм мобилизует две системы иммунной защиты — антитела и Т-лимфоциты, или Т-клетки. Гуморальный ответ на инфекцию SARS-CoV-2 (выработка антител, которые перехватывают вирус и не позволяют ему заразить клетку) изучен довольно хорошо, чего не скажешь про Т-клеточный¹. Однако именно Т-лимфоциты не только обнаруживают и уничтожают инфицированные клетки, но и влияют на долговременную иммунную память. Как исследуют Т-клеточный иммунитет? Есть ли отличия в его формировании у людей, переболевших COVID-19, и вакцинированных? Защитят ли вакцины, созданные к изначальному варианту SARS-CoV-2, от его мутантов? На эти и другие вопросы ответил кандидат биологических наук Григорий Александрович Ефимов, заведующий лабораторией трансплантационной иммунологии Национального медицинского исследовательского центра гематологии.

Г. А. Ефимов

— Григорий Александрович, не могли бы Вы для начала кратко пояснить, что такое Т-клеточный иммунный ответ и чем от отличается от гуморального (образования антител)?

Антитела (иммуноглобулины) — это молекулы, которые циркулируют в организме, их функция — перехватить вирус, не дать ему заразить клетку. Т-лимфоциты — это живые клетки, которые могут размножаться, и их потомство будет выполнять те же функции, что и зрелые Т-лимфоциты. За счет своих рецепторов они связываются с молекулами на поверхности другой клетки и могут узнать, что она заражена. Мишень Т-лимфоцитов — не сам вирус, а инфицированная клетка; они ее убивают и таким образом прерывают цепочку его размножения.

Среди Т-лимфоцитов есть разные субпопуляции. Уничтожением зараженных клеток занимаются цитотоксические лимфоциты, или Т-киллеры, они несут на своей поверхности отличитель-ный маркер — молекулу корецептора CD8. Другая субпопуляция — это Т-хелперы, несущие маркер CD4; они играют роль иммунного регулировщика. С одной стороны, они помогают цитотоксическим лимфоцитам, а с другой — В-лимфоцитам, которые производят антитела. Без Т-клеточного иммунитета и антитела не будут производиться. Именно Т-хелперы с помощью рецептора CD4 распознают антиген и сообщают В-лимфоцитам, что это нечто действительно опасное и на него можно производить антитела, которые не будут направлены против самого организма.

— А как и из чего образуются Т-клетки памяти?

Предшественники Т-лимфоцитов выходят из костного мозга и отправляются в тимус (отсюда «Т» в их названии). В тимусе Т-лимфоциты созревают, приобретая Т-клеточные рецепторы (ТКР) и дополнительные корецепторы (напомню, CD8 — для цитотоксических клеток, CD4 — для хелперных). Из тимуса выходят зрелые, но наивные (не активированные) Т-лимфоциты, которые еще не встретили свой антиген. Активация Т-лимфоцитов происходит тогда, когда ТКР взаимодействуют с антигеном, который представляют на своей поверхности антигенпрезентирующие клетки. Представляют (презентируют) антиген молекулы главного комплекса гистосовместимости (МНС²). Активированные Т-лимфоциты интенсивно делятся, причем делятся асимметрично. Одна их часть превращается в дифференцированные эффекторные клетки, которые выполняют функции Т-киллеров или Т-хелперов, после этого погибают путем апоптоза. Другая часть образует Т-клетки памяти, которые сохраняются в неактивной форме до тех пор, пока не произойдет повторного контакта с тем же антигеном.

На самом деле все немного сложнее — это не бинарная классификация, свойства эффекторных клеток и клеток памяти образуют некий градиент, и по этому градиенту клетка может располагаться ближе к эффекторным клеткам или к клеткам памяти, что зависит от экспрессии определенных генов. Благодаря тому, что в клетках памяти сохраняется информация об антигене, при повторной встрече с ним иммунный ответ развивается гораздо быстрее. Клетки снова начинают асимметрично делиться, нарабатывают пул эффекторных клеток, которые атакуют зараженные вирусом клетки и снова образуют клетки памяти. Именно поэтому при повторной встрече с антигеном иммунологическая память усиливается.

— Каковы были предпосылки к тому, чтобы начать изучать Т-клеточный иммунитет у переболевших COVID-19? Ориентировались ли вы на пример другого инфекционного заболевания?

Была информация про Т-клеточный ответ на SARS-CoV-1³, близкородственный вирус, и были эксперименты на животных, в которых пытались разделить клиническую роль Т-клеточного ответа и гуморального (с помощью антител). Так, животных иммунизировали Т-клеточным антигенами, которые не вызывают выработку антител, и животные выживали, а в контрольной группе погибали от вируса. В другом исследовании животным переливали Т-лимфоциты, и даже в отсутствие антител они успешно боролись с вирусом.

Для нашей лаборатории Т-лимфоциты — это основной объект, мы ими давно занимается. Например, сейчас у нас идет программа по цитомегаловирусной инфекции, клинические исследования переливания Т-лимфоцитов от здоровых доноров к больным. Эти больные — иммунодефицитные, у них нет своего Т-клеточного иммунитета, но чужие Т-лимфоциты способны в их организме бороться с инфекцией.

— У вас вышла статья в журнале «Immunity» по исследованию Т-клеточного ответа у переболевших COVID-19⁴. Вы показали, что он очень разнообразен у разных людей и не коррелирует с наличием антител. Кроме того, Т-клеточный ответ у разных людей развивался на разные антигены SARS-CoV-2. Это так?

Выводы у нас были такие. Во-первых, мы увидели, что Т-клеточный ответ есть и у некоторых людей, которые не болели COVID-19, в работах некоторых других групп это также было показано.

Во-вторых, Т-клеточный ответ наблюдался у части людей, у которых антител не было. Нельзя сказать, что эти два вида иммунного ответа совсем не коррелируют, скорее, они коррелируют, и мы сейчас это видим, когда продолжаем исследования. Обычно, когда наблюдается сильный гуморальный ответ, то присутствует и сильный Т-клеточный ответ, и наоборот. Но не всегда. Вывод нашего исследования в том, что невозможно с помощью одного только инструмента сказать о протективной роли иммунного ответа. Вероятно, некоторым людям в отсутствие антител достаточно Т-клеточного ответа, чтобы он защитил их от инфекции, это очень похоже на правду.

А что касается того, что он у разных людей развивается на разные антигены, это естественно. То, какие антигены будут распознаваться, зависит от того, какие аллели МНС есть у людей. Мы все генетически разные в этом смысле. Эволюционный смысл такого разнообразия в том, что у разных людей клетки презентируют разные антигены вируса, вернее, разные фрагменты антигенов — эпитопы, и вирусу не так просто приобрести мутацию, которая нарушит эту систему. То, что для одного человека будет уходом от распознавания, для другого не будет уходом, потому что разные люди «видят» разные фрагменты вируса. Хорошо, что это так, иначе мы бы были, как животные чистой генетической линии, очень уязвимы. Тот факт, что эпитопов для узнавания антигена много — это тоже очень хорошая новость: чем больше разных эпитопов видит наша иммунная система одновременно, тем сложнее вирусу образовать «эскейп-мутанты»⁵, которые могут уйти от иммунной системы.

— Уточним — у некоторых людей Т-клеточный ответ может быть настолько мощным, что они не заболевают при контакте с вирусом, и при этом у них не вырабатываются антитела?

Видимо, дело не в том, что он мощный, но он достаточен для защиты. Но такого, что у тех, у кого нет антител, Т-клеточный ответ был бы сильнее, мы не видим.

— Есть еще Т-клеточные рецепторы. Насколько они у разных людей разнообразны, и как они связаны с иммунным ответом?

Т-клеточный рецептор формируется случайным образом, когда в процессе созревания в тимусе в геноме лимфоцита происходит перестройка генетических сегментов, которые его кодируют. Каждый наивный лимфоцит приобретает свой рецептор независимым образом. А дальше, если оказывается, что этот Т-клеточный рецептор способен распознать какой-то эпитоп антигена, то этот лимфоцит размножается. Мы анализируем то, что называется репертуаром Т-клеточных рецепторов, и видим, что произошла экспансия какого-то генетического клона.

Несмотря на то, что они совершенно самостоятельно формируются, Т-клеточные рецепторы, распознающие один и тот же эпитоп, могут быть похожи у разных людей. В принципе, это логично, потому что это система «ключ-замок»: если замки похожи, то и ключи должны быть похожи. Хотя и не всегда. Бывает, что последовательности у разных людей совпадают буквально до буквы, такие рецепторы называются публичными. Бывает, что они не полностью совпадают, а просто имеют высокую степень гомологии, гораздо большую, чем в среднем рецепторы между собой. Мы такие группы гомологии описываем в своей работе. Это позволяет определить, какие фрагменты вируса распознаются, всего лишь на основании последовательностей Т-клеточных рецепторов. Узнав, как устроен рецептор, распознающий определенный фрагмент вируса, мы можем у любого человека посмотреть репертуар Т-клеточных рецепторов и попробовать найти похожий. Найдя похожую последовательность, мы понимаем, что у этого человека происходит распознавание того же антигена, а значит, есть Т-клеточный ответ, в данном случае, на коронавирус. Сейчас мы проводим исследование, в котором по последовательности Т-рецепторов классифицируем людей на тех, кто перенес коронавирусную инфекцию, и тех, кто нет. Есть и другие группы, которые этим занимаются. В США уже зарегистрирован тест на Т-клеточный иммунитет, который устроен по этому принципу.

— Вы ищете общие Т-клеточные рецепторы к конкретному эпитопу?

Да, у каждого патогена есть такие эпитопы, которые являются иммунодоминантными. Если иммунный ответ происходит, то на них он происходит чаще, чем на другие. И на основе этих эпитопов можно сконструировать тест на Т-клеточный иммунитет.

— Вы уже упоминали, что обнаруживали Т-клеточный ответ у некоторых людей, которые не болели COVID-19. Означает ли это кросс-реактивность? Насколько я знаю, такая гипотеза высказывалась и другими исследователями — что защиту от COVID-19 могут оказывать Т-клетки памяти, сформировавшиеся у людей после перенесенных сезонных коронавирусов.

Это почти наверняка так. Мы отмечали, что в некоторых образцах крови, которые хранились в биобанке (были взяты до пандемии), наблюдался Т-клеточный ответ на антигены SARS-CoV-2.

Какие еще есть аргументы? Есть несколько работ, в которых у таких доноров, которые не встречались с коронавирусом, выделили Т-лимфоциты, и оказалось, что они распознают и фрагменты сезонных коронавирусов, и фрагменты SARS-CoV-2, т. е. напрямую была продемонстрирована их способность к перекрестному распознаванию. Конечно, сезонные коронавирусы — это первые подозреваемые, но в принципе могут быть и другие инфекции, которые для нас не похожи, а для Т-лимфоцитов те короткие фрагменты, которые они распознают, оказываются достаточно похожими. Есть еще британское исследование, в котором проспективно прослеживали защитную роль Т-ответа. Они набирали когорту испытуемых прошлой весной из групп высокого риска — медицинские работники, полицейские, работники экстренных служб — и потом прослеживали, кто из них заболел, кто нет. И оказалось, что наличие Т-лимфоцитов, кросс-реактивных, скорее всего, защищает людей от заболевания.

— Сейчас вы исследуете Т-клеточный иммунитет у людей, вакцинированных от COVID-19. Отличается ли он у переболевших и у вакцинированных?

Из общих соображений иммунный ответ у вакцинированных сфокусирован на тех эпитопах, которые содержатся в вакцине, если это векторная вакцина, как «Спутник V». По силе иммунного ответа мы напрямую не сравнивали переболевших и вакцинированных, так как сила ответа очень зависит от временной точки, в которой мы его оцениваем. Потому что фаза экспансии Т-лимфоцитов сменяется фазой сокращения — большое число эффекторных Т-лимфоцитов очень быстро погибнут. С вакцинированными гораздо проще, потому что известна точная дата прививки. Но в целом есть ощущение, что у вакцинированных иммунный ответ сильнее, чем у переболевших, по крайней мере, чем у переболевших в легкой форме, которых большинство. Что касается стойкости иммунного ответа, то, чтобы ответить на этот вопрос, нужно непосредственно сравнить тех и других в одном исследовании. Мы такого не делали. Но мы можем сказать, что Т-клеточный ответ виден в диапазоне шести месяцев и у той, и у другой группы.

— Какие клетки вы видите через шесть месяцев? Это уже не эффекторные клетки, а клетки памяти?

Да, это клетки памяти, которые реагируют на те же антигены, с которыми ранее сталкивались.

— Вы продолжаете работать с вакцинированными, можно ли сказать, когда будут получены результаты и когда ожидается публикация?

Я надеюсь, что через пару месяцев мы должны завершить эту работу. Сейчас мы пытаемся сделать нечто похожее на то, что сделали, когда исследовали переболевших. Мы смотрим, какие клоны Т-клеточных рецепторов распознают эпитопы, в данном случае S-белка⁶, насколько разнообразен Т-клеточный ответ по клональной структуре, какое количество клонов в него вовлечено и насколько эти клоны пересекаются между собой у разных доноров, как это зависит или не зависит от их аллелей МНС. Интересно, насколько эта картина пересекается с той картиной Т-клеточных рецепторов, которую мы получили у переболевших. И как эти конкретные клоны ведут себя во времени — мы на определенных временных точках пытаемся проследить их судьбу: как они сначала размножаются, потом сокращаются, и как они образуют Т-клетки памяти; сколько этих клонов было непосредственно после вакцинации и сколько их сохранилось в течение шести месяцев.

— В конце февраля опубликован препринт статьи, в которой показано, что у людей, инфицированных разными вариантами SARS-CoV-2 (в том числе британским и южноафриканским штаммами), а также вакцинированных вакцинами Moderna и Pfizer, Т-клетки реагировали на эпитопы вирусных белков, не затронутых мутациями⁷. Это говорит о том, что появление новых вариантов вируса не должно влиять на Т-клеточный иммунитет?

Это логично. Для сравнения: нейтрализующие антитела направлены на конкретный функционально важный участок — рецептор-связывающий домен (RDB⁸) S-белка, который они должны связать. Соответственно, мутации в этом конкретном участке — и это уже показано — снижают способность антител к связыванию антигена. Поэтому другой штамм вируса они могут нейтрализовывать гораздо хуже. Т-клетке все равно; важен функциональный участок, который она распознает или нет. Это может быть фрагмент другого белка, не спайк, но даже если и спайк, у него же много разных эпитопов. И мы, и другие исследователи показали, что распознается сразу большое количестве Т-клеточных эпитопов. Вероятность, что все они будут затронуты мутациями, крайне мала. А то, какой эпитоп у данного человека будет презентироваться и, соответственно, распознаваться, зависит от аллелей его системы МНС. Поэтому мутация какого-то эпитопа для одного человека снизит распознавание, а для другого человека не будет играть никакой роли. В этом смысле Т-клеточный иммунитет гораздо лучше защищен от мутаций вируса, чем гуморальный.

— Еще одна важная публикация по вашей теме вышла совсем недавно⁹. В этой работе исследованы иммуногенные участки белков SARS-CoV-2, способных активировать Т-лимфоциты. И наиболее иммуногенными оказались не S-белок, а белки ORF1 и ORF3. Насколько этот результат для вас ожидаемый и повлияет ли он как-то на вашу работу?

Подобные работы были и раньше, находили вирусные эпитопы, которые оказывались очень иммуногенными. Это важно, потому что информацию о таких доминантных эпитопах нужно учитывать в разработке тест-систем на Т-клеточный ответ. В частности, мы сделали тест-систему, которая основана на знании о таких иммунодоминантных эпитопах. Но то, что ответ на другой белок сильнее, чем на спайк, не значит, что S-белок — плохая мишень. Разработчики вакцины хотели убить двух зайцев — обеспечить и антитела, и Т-клеточный ответ. А последний устроен так, что есть некие иммунодоминантные эпитопы, но если вы их исключите, например мутацией, то Т-клеточный ответ перефокусируется на другие эпитопы. Поэтому то, что в вакцине есть S-белок и нет другого, возможно, более иммуногенного белка, делает Т-клеточный ответ просто сфокусированным на S-белок. Это не значит, что ответ будет слабее. Иными словами, такие данные важны, но вакцину они не обесценивают.

— По вашему мнению, нужна ли человеку информация о состоянии своего Т-клеточного иммунитета после болезни или прививки, чтобы знать, насколько он защищен?

С одной стороны, я, как разработчик, должен вроде бы рекламировать тесты на Т-клеточный ответ. Но, если подходить к этому вопросу разумно, для большинства людей, у которых после вакцинации образовались антитела, этого совершенно достаточно, и Т-клетки у них тоже, скорее всего, есть. Учитывая то, что тесты на Т-клеточный ответ и более сложные технически, и более дорогие в производстве, и для потребителя они будут дороже, я бы не стал советовать всем людям бежать и проверять свои Т-лимфоциты. Есть какието отдельные случаи, когда это имеет смысл. Например, когда вакцинация не привела к выработке антител, хотя в этом плане вакцина «Спутник V» довольно эффективная. Но есть люди, у которых не образуются антитела, и чем человек старше, тем выше такая вероятность. Возможно, это связано с тем, что у человека высокий иммунный ответ на вектор — аденовирус, с которым он много раз встречался, и он не дает выработаться антителам на S-белок. Для таких людей, наверное, имеет смысл проверить, что Т-клеточный иммунитет сформировался. И мы, как правило, видим, что он у них есть. Кроме того, вакцина проверялась на здоровых добровольцах, но есть люди с заболеваниями системы кроветворения, иммунной системы, онкологическими заболеваниями, и их лечащим врачам хочется оценить эффект вакцинации более подробно. Ну и переболевшим, у которых через какое-то время антитела пропали, тоже имеет смысл проверить Т-клеточный иммунитет. А всем поголовно я бы категорически не советовал это делать.

— Расскажите про вашу тест-систему на Т-клеточный ответ. Как давно вы ее создали и как она работает?

Мы довольно давно разработали тест-систему, но надо еще пройти некоторые юридические формальности для того, чтобы она стала доступна широкому кругу желающих. Я очень надеюсь, что в ближайшее время начнутся ее клинические испытания, и она получит регистрационное удостоверение Росздравнадзора. Пока она не зарегистрирована, мы ее можем использовать только в исследовательских целях. Но мы можем сказать, что она работает достаточно хорошо, у нее высокая чувствительность и специфичность.

Она работает по следующем принципу. Мы берем у человека периферическую кровь, содержащую живые лимфоциты, — это то, почему тест-системы на Т-лимфоциты сложнее в разработке и применении, для них нужны живые клетки. Если для антител можно взять сыворотку, можно заморозить ее, то здесь нужны живые клетки и лаборатория, которая умеет с ними работать, и это более сложные манипуляции в стерильных условиях. Т-лимфоциты несколько часов инкубируются с фрагментами антигенов коронавируса, про которые мы знаем, что они вызывают ответ у переболевших или вакцинированных, вне зависимости от того, какие у них аллели МНС. Мы подбирали эти фрагменты таким образом, чтобы покрыть популяцию как можно более широко. Второй критерий отбора — они не должны вызывать кросс-реактивного ответа, т. е. мы сознательно исключали потенциальную кросс-реактивность, чтобы отделить в этом тесте ответ на SARS-CoV-2 от ответа на предшествующие вирусы, например сезонные коронавирусы (хотя он может быть тоже протективен).

Работа тест-системы основана на методе ELISpot, где мы видим следы от конкретных Т-лимфоцитов, которые активировались и вырабатывают ≥-интерферон, и можем подсчитать количество этих следов. Хотя при этом наша тестсистема не количественная, а качественная — результат выше определенного порога трактуется как положительный, ниже порога — как отрицательный.

— Как будут проходить клинические исследования тест-системы?

Мы провели свои внутренние исследования. Клинические исследования должна проводить независимая лаборатория, в данном случае это будет Национальный медицинский исследовательский центр детской гематологии, онкологии и иммунологии имени Димы Рогачева, у них большой опыт работы с этим методом. Они будут набирать переболевших людей (взрослых) с подтвержденным диагнозом и вакцинированных, а для контрольной группы — людей, заведомо не болевших и не вакцинированных. К сожалению, мы не может вернуться назад, в период до пандемии, так что им придется ориентироваться на другие показатели, говорящие о том, что человек не сталкивался с новым коронавирусом.

— Удачи в клинических исследованиях вашей тест-системы и в вашей дальнейшей работе.

Интервью подготовила кандидат биологических наук Н. В. Маркина
Институт общей генетики имени Н. И. Вавилова (Москва, Россия)

¹ Подробнее об особенностях формирования иммунитета в ответ на инфекцию, вызванную коронавирусом SARS-CoV-2, см.: Кондратова М.С. Не «просто грипп», или особенности иммунного ответа при COVID-19. Природа. 2020; 6: 3–7. DOI:10.7868/ S0032874X20060010.

² Аббревиатура англ. major histocompatibility complex — главный комплекс гистосовместимости. — Примеч. ред.

³ SARS-CoV-1 — коронавирус, который вызвал в 2002–2003 гг. эпидемию тяжелого острого респираторного синдрома (англ. severe acute respiratory syndrome). — Примеч. ред.

⁴ Shomuradova A.S., Vagida M.S., Sheetikov S.A., ..., Efimov G.A. SARS-CoV-2 epitopes are recognized by a public and diverse repertoire of human T cell receptors. Immunity. 2020; 53(6): 1245–1257. DOI:10.1016/j.immuni.2020.11.004.

⁵ Эскейп-мутанты (от англ. escape — убегающий, ускользающий) — это варианты вируса, устойчивые к нейтрализующему действию моноклональных антител. — Примеч. ред.

⁶ S-белок (от англ. spike — шип) — поверхностный гликопротеин, который отвечает за проникновение вируса в клетку. Эти структуры (далее в тексте упоминаются как «спайк») в виде шиповидных отростков на липопротеиновой оболочке окружают вирион SARS-CoV-2. Вакцина Гам-КОВИД-Вак (торговое название «Спутник V») создана на основе инактивированного аденовируса, который содержит в геноме вставку, кодирующую фрагмент S-белка SARS-CoV-2, вызывающего иммунный ответ. — Примеч. ред.

⁷ Tarke A., Sidney J., Methot N. et al. Negligible impact of SARS-CoV-2 variants on CD4+ and CD8+ T cell reactivity in COVID-19 exposed donors and vaccinees. BioRxiv. 02.2021. DOI:10.1101/ 2021.02.27.433180.

⁸ Аббревиатура англ. receptor-binding domain — рецептор-связывающий домен. — Примеч. ред.

⁹ Saini S.K., Hersby D.S., Tamhane T. et al. SARS-CoV-2 genomewide T cell epitope mapping reveals immunodominance and substantial CD8+ T cell activation in COVID-19 patients. Sci. Immunol. 2021; 6(58): eabf7550. DOI:10.1126/sciimmunol.abf7550.