Железнодорожный червь

На фото — личинка жука фриксотрикса (Phrixothrix), за необычную способность к разноцветной люминесценции получившая название «железнодорожный червь» (Railroad worm). На боках у нее горят зеленые огоньки-фотофоры, а голову украшают красные. Ползущая в сумерках, такая личинка действительно напоминает железнодорожный состав со светящимися окошками вагонов и красными огнями локомотива.

Живых организмов, умеющих светиться, на Земле довольно много — это и грибы, и насекомые, и рыбы, и кораллы с медузами, губки, рачки, иглокожие и моллюски (см. подборку статей по теме Биолюминесценция). Фриксотрикс, обитающий в Центральной и Южной Америке, любопытен тем, что его самки и личинки светятся двумя разными цветами одновременно. Это гораздо более редкая, хотя и не уникальная черта. А люминесценция в красном свете встречается еще реже, среди жуков на нее способен только фриксотрикс.

У этого рода жуков явно выражен половой диморфизм: взрослые самцы имеют вполне привычный «жучиный» облик, в то время как самкам свойственна неотения — они всю жизнь сохраняют личиночный вид. Кроме этого, самцы намного мельче самок: длина тела самца 13,6 мм, самки — 60 мм.

Слева — самец Phrixothrix gibbosus. Фото © J. L. Giuglaris с сайта inpn.mnhn.fr. Справа — самка или личинка, фото © Aaron Pomerantz с сайта ru.wikipedia.org

Отличить самку от личинки можно по наличию отверстия для кладки яиц (см. ooporus). Личинки и самки имеют одинаковые органы люминесценции — фотофоры — и светятся одинаково: зелеными огоньками вдоль туловища и красными — на голове. Самцы утрачивают способность к красному свечению, у них остаются только зеленые фотофоры за головой.

В чем секрет красной люминесценции фриксотрикса, какие задачи она выполняет, какая химия лежит в основе этого процесса и почему люминесценция не нужна cамцам, неизвестно до сих пор. Давайте вспомним, что такое биолюминесценция и как она работает.

Биолюминесценция — это способность живых организмов к свечению. Она может происходить в органах, органеллах или цитоплазме клеток, но принцип всегда одинаков — выделение света в результате химической реакции.

Не любая химическая реакция заканчивается излучением света, и вот почему. Для хемилюминесценции (а именно так называются процессы с выделением света в результате химических реакций, и, следовательно, свечение живых организмов является биохемилюминесценцией, но часть «хеми» обычно опускают) необходимо, чтобы количество энергии, выделяющейся в ходе реакции, попадало в диапазон ~170–300 кДж/моль. Почему именно столько? Свет несет определенную энергию, связанную с его частотой: чем выше частота света, тем выше его энергия. Кроме того, излучается и поглощается свет минимальными порциями — квантами. Следовательно, чтобы частица вещества (атом или молекула) могла излучить квант света, ей необходимо передать энергию больше, чем энергия этого кванта, иначе частице просто «не хватит заряда». Энергия, необходимая для излучения кванта красного света (длина волны 630 нм, частота ν = 4,76·10¹⁴ Гц), равна

E = hν = (6,63·10⁻³⁴ Дж·с) · (4,76·10¹⁴ Гц) = 28,57·10⁻²⁰ Дж,

(h — постоянная Планка, h = 6,63·10⁻³⁴ Дж·с).

В моле вещества таких частиц содержится число Авогадро штук: N_A=6,02·10²³. Таким образом, нижняя, «красная», граница хемилюминесценции и получается равной 28,57·10 · 6,02·10²³ = 172 кДж на один моль. Верхняя граница для фиолетового света получается аналогично и дает приблизительное значение 300 кДж/моль. То есть энергетический выход реакции должен быть таким, чтобы энергии, приходящейся на каждую частицу в веществе, хватало на излучение фотона в видимом диапазоне.

В такой химической реакции всегда участвуют два специфических типа соединений: люциферин и люцифераза. Это именно типы, конкретные вещества за этими названиями могут скрываться самые разные. Люциферины бактерий, грибов, моллюсков — это совершенно различные вещества, объединяет которые только способность окисляться, образуя при этом новое вещество — оксилюциферин, — находящееся в возбужденном состоянии (см. Возбужденные атомы: 1. Кто такие и где встречаются). Через некоторое время оксилюциферин «успокаивается», возвращаясь в основное энергетическое состояние, и «сбрасывает» избыток энергии в виде кванта света.

Однако скорость реакции окисления, как правило, очень низка. Для ее ускорения (а следовательно, и для увеличения интенсивности излучаемого света) требуется катализатор, в роли которого и выступает люцифераза — сложная белковая структура, фермент; она значительно (в тысячи раз) повышает скорость протекания реакции, но сама при этом не расходуется.

Цвет люминесценции может зависеть от множества различных параметров, например от типа люциферина. Если оксилюциферин существует в виде нескольких форм, для каждой из которых уровни основного энергетического состояния различны, это тоже скажется на спектре излучения. Также причиной разных цветов могут быть различные условия в микроокружении возбужденного оксилюциферина, то есть в той среде, в которой он непосредственно находится.

В 1993 году ученые выяснили, что причиной разноцветной люминесценции железнодорожного червя являются именно две разные люциферазы (зеленая PxGR и красная PxRE), взаимодействующие с одним и тем же субстратом — D-люциферином светлячка (см. Firefly luciferin). В этом отношении он сходен с ямайским жуком-щелкуном Pyrophorus plagiophthalamus, который излучает свет от зеленого (с длиной волны 546 нм) до оранжевого (593 нм), используя четыре разные люциферазы! Однако фриксотрикс гораздо более «длинноволновый» — его головные фонари светятся в красном свете с длиной волны 620 нм у вида Phrixothrix vivianii и 636 нм у вида Phrixotrix hirtus.

Люцифераза — очень крупная белковая молекула, намного превосходящая по своим размерам относительно несложный и небольшой люциферин: к примеру, люциферин светлячка, выделенный впервые в 1957 году, имеет массу ядра 280 Da (атомных единиц массы), а люцифераза светлячка — 50 000 Da. В люциферазе имеется углубление («полость» или «карман»), куда вовлекается люциферин и где и происходит их взаимодействие.

Модель взаимодействия люциферазы и люциферина на примере звездного разрушителя и «Тысячелетнего сокола» из фильмов «Звездные войны»

Внутри полости располагается активный центр — участок белковой молекулы, сформированный аминокислотами так, что расположение их ионов соответствует расположению ионов люциферина, в результате чего при сближении на расстояние 15–20 Å они вступают в ионную связь.

Люциферин погружается в карман люциферазы, где его поджидают узлы активного центра, точно соответствующие структурным особенностям люциферина. Рисунок © Виктор Ink Трубников

В прошлом году бразильские ученые выяснили, что основной причиной красной люминесценции при участии PxRE — единственной природной люциферазы, порождающей столь длинные волны, — является её большой карман.

В большей полости эмиттер (то, что непосредственно испускает свет, в нашем случае — оксилюциферин) быстрее теряет энергию. А цвет кванта света, испускаемого оксилюциферином при переходе из возбужденного состояния в основное, зависит от разницы в энергии между этими состояниями. Чем меньшей энергией обладает эмиттер в возбужденном состоянии, тем менее энергетичный фотон он выпустит, тем более длинноволновым и низкочастотным будет этот квант (более длинноволновая область соответствует красному участку видимого спектра). И, напротив, больший уровень энергии возбужденного состояния вызовет смещение спектра в сторону зеленого и синего цветов.

Энергия возбужденного состояния зависит не только от того, на какой энергетический уровень «забросили» электрон в атоме, но и от энергии его взаимодействия с микроокружением (содержимым полости, непосредственно окружающим эмиттер) — так называемой энергии сольватации. Дело в том, что микроокружение — раствор это или белок — представляет собой диэлектрическую среду. А переход оксилюциферина в возбужденное состояние изменяет его дипольный момент. Молекулы микроокружения начинают переориентироваться под действием новой конфигурации электрического поля, и чем большее число молекул удастся переориентировать оксилюциферину, тем больше энергии он потеряет и тем краснее будет выпущенный им фотон. В большой полости PxRE люциферазы больше места для молекул воды и для возбужденной подвижности оксилюциферина, поляризующей окружающую среду, что приводит к смещению спектра в длинноволновую область.

В то же время в меньшей полости, обнаруженной в зелено-желтых излучающих люциферазах (в частности, в PxGR), взаимодействия между возбужденным оксилюциферином и активным центром более жесткие (то есть между ними более сильные ионные связи), что уменьшает подвижность и поляризующую активность оксилюциферина и тем самым предохраняет его от потерь энергии.

Длинноволновая биолюминесценция перспективна для применения в биомедицинских исследованиях, в частности, в биоимиджинге (см. Bioluminescence imaging). Это технология, позволяющая исследовать процессы в живых организмах неинвазивно, то есть без хирургического вмешательства, например, при помощи биолюминесцентной томографии. Также биоимиджингом пользуются для тестирования лекарств против рака. При этом в исследуемые ткани вводят компоненты люциферин-люциферазной системы, например, светлячков или бактерий.

Но у всех используемых систем диапазон свечения лежит в областях синего и зеленого цветов. К сожалению, на этих частотах свет, и без того слабый, активно поглощается изучаемой тканью. Однако волны в области красного и дальнего красного цвета проходят ткань с гораздо меньшими потерями. Именно этим обусловлен повышенный интерес к люминесценции железнодорожного червя и механизмам его головного красного свечения. Теперь уже недостаточно знания того, что разноцветная люминесценция объясняется наличием в теле фриксотрикса одновременно двух люцифераз — нужно узнать, какие особенности их строения вызывают смещение спектра в красную область.

А для поиска ответа нужно много люциферазы. Раньше люциферазу для исследований собирали непосредственно из носителей, что было очень трудоемко. Для получения 1 мг фермента требовалось около тысячи светлячков! Но с конца XX века, когда был выделен ген люциферазы, его стали включать в клетки кишечной палочки (Escherichia coli) и получать неограниченные количества люциферазы. А это, в свою очередь, позволило генно модифицировать люциферазу, получая её мутировавшие версии с различными свойствами.

Бразильские ученые совместно с японскими коллегами получили в лаборатории люминесценцию в дальнем красном свете, модифицировав PxRE люциферазу железнодорожного червя и люциферин светлячка. Полученные системы обладают более высокой активностью биолюминесценции и более красными спектрами и очень перспективны для применения в биоимиджинге. Например, для изучения клеток млекопитающих, поглощающих свет с короткой длиной волны (клеток крови и мышц) — они попадают в так называемое «окно прозрачности биологических тканей».

Вверху — свет железнодорожного червя Phrixotrix hirtus. Внизу — красная и дальняя красная биолюминесценция кишечной палочки, экспрессирующей PxRE люциферазу в присутствии D-люциферина (A); 6'-морфолинолюциферина (B) и 6'-пирролидиниллюциферина (С). Изображение из статьи V. R. Bevilaqua et al., 2019. Phrixotrix luciferase and 6′-aminoluciferins reveal a larger luciferin phenolate binding site and provide novel far-red combinations for bioimaging purposes

Фото с сайта biotabiolum.ufscar.br.

Василий Деревянко