Создана новая система контролируемой экспрессии генов на основе Cre-рекомбиназы

Рис. 1. Скопление вирионов бактериофага P1, запечатленное с помощью трансмиссионного электронного микроскопа и окрашенное в псевдоцвета. Взятый из этого фага белок Cre лег в основу новой системы, позволяющей управлять экспрессией интересующего ученых гена в культуре живых клеток. Фото с сайта sciencephotogallery.com

Системы контролируемой экспрессии генов позволяют ученым доставить в модельную клетку интересующий их ген, а затем включать и выключать его экспрессию по своему усмотрению. Одно из основных применений этих систем — исследование функций белков. Ученые из МГУ им. М. В. Ломоносова создали многообещающую систему контролируемой экспрессии, использующую белок Cre бактериофага P1. Новая система обладает важным качеством — низкой «фоновой» экспрессией таргетного гена, когда система не активирована, и его высокой экспрессией, когда система активирована.

Не все белки нужны клетке постоянно и в одном и том же количестве. Основную роль в регуляции экспрессии генов (синтеза закодированных в генах молекул) играют участки ДНК, располагающиеся перед генами, — промоторы и энхансеры. Чтобы с гена считывалась матричная РНК — то есть, происходила его транскрипция, — перед ним должен собраться специальный белковый комплекс инициации транскрипции. Сборку этого комплекса начинают особые белки — транскрипционные факторы, которые связываются с промоторами и энхансерами и привлекают остальные компоненты комплекса. Транскрипционные факторы имеют ДНК-связывающий домен, позволяющий им узнавать определенные последовательности нуклеотидов в промоторах, и активаторный домен, привлекающий необходимые для транскрипции белки (как это все работает, можно посмотреть в этом видео). Транскрипционные факторы могут быть более универсальными или более специфичными к конкретным промоторам.

Благодаря развитию генной инженерии ученые теперь могут вводить интересующие их гены в клеточные культуры и модельные организмы и регулировать экспрессию этих генов, добавляя молекулы-активаторы. Контролируемая экспрессия целевых генов — мощный инструмент для изучения их функций. Например, с его помощью удалось разобраться, какие гены отвечают за различия формы листьев у двух близких видов растений (M. Barkoulas et al., 2008. A developmental framework for dissected leaf formation in the Arabidopsis relative Cardamine hirsuta). Также с помощью контролируемой экспрессии генов можно изучать последствия мутаций в этих генах.

Минимальный «набор» для контролируемой экспрессии чужеродного гена должен содержать исследуемый ген, сшитый с определенным промоторным участком, и активатор экспрессии, узнающий этот промотор.

Существует множество искусственных систем для контролируемой экспрессии генов, и создавать их помогает сама природа. Например, одна из наиболее часто применяющихся систем использует в качестве активатора антибиотик тетрациклин и была подсмотрена у бактерий (A. T. Das et al., 2016. Tet-On Systems For Doxycycline-inducible Gene Expression). Дело в том, что у некоторых штаммов кишечной палочки Escherichia coli есть ген белка tetA, обеспечивающего бактерии устойчивость к тетрациклину. Но в отсутствие антибиотика этот белок вреден: во-первых, на его синтез уходят ресурсы, во-вторых, он обладает побочными эффектами для жизнедеятельности бактериальной клетки. Поэтому по умолчанию на промоторе гена устойчивости сидит белок-репрессор, препятствующий сборке РНК-полимеразного комплекса (см. Tet Repressor proteins). Но тетрациклин, попав в клетку, связывается с белком-репрессором, что приводит к его отсоединению от промотoра и, тем самым, к активации транскрипции гена устойчивости (см. Tetracycline-controlled transcriptional activation).

Рис. 2. Тетрациклин используется как для активации (Tet-On системы), так и для репрессии (Tet-Off системы) транскрипции. Рисунок из статьи J. Evans, V. Mizrahi, 2015. The application of tetracyclineregulated gene expression systems in the validation of novel drug targets in Mycobacterium tuberculosis

Не только бактерии вдохновляют авторов систем контролируемой экспрессии. Например, есть система, основанная на использовании растительного белка фитохрома B в паре с транскрипционным фактором PIF6 (phytochrome-interacting factor 6). Запускает экспрессию красный свет (длина волны 660 нм), а выключает — дальний красный (740 нм). Фитохромы — белки растений, меняющие свою конформацию под действием света с разной длиной волны: красный свет активирует белок, дальний красный переводит его в неактивное состояние. Фитохромы и другие фоторецепторные белки помогают растениям «видеть», что происходит вокруг, и реагировать на изменение освещенности, например, из-за затенения другими растениями (Y. Zhang et al., 2020. Central clock components modulate plant shade avoidance by directly repressing transcriptional activation activity of PIF proteins). В разработанной учеными системе фитохром B под воздействием красного света активируется и связывается с PIF6, к которому пришит домен, позволяющий ему узнавать промотор, поставленный перед целевым геном, и, тем самым, активировать экспрессию этого гена (K. Müller et al., 2013. A red/far-red light-responsive bi-stable toggle switch to control gene expression in mammalian cells).

Конечно, идеального варианта нет, и все системы контролируемой экспрессии в той или иной степени обладают следующими недостатками:
1) неспецифическая активация нецелевых генов, приводящая к нежелательным воздействиям на жизнедеятельность клеток;
2) ненулевая экспрессия целевого гена в отсутствии активатора (эту проблему называют «подтеканием» промотора);
3) неэффективная доставка активаторов в клетку (например, в случае их больших размеров).

Кроме того, разные системы показывают разную эффективность в разных условиях. Поэтому новые системы контролируемой экспрессии продолжают создаваться, а старые — совершенствоваться. Недавно в журнале Cells была опубликована статья, в которой сотрудники Факультета фундаментальной медицины МГУ представили новый вариант такой системы.

Работа началась с поиска сравнительно коротких ДНК-связывающих белков с высокой специфичностью, не имеющих участков связывания в геномах человека и мыши (это важно для предотвращения побочной активации генов при использовании будущей системы в культурах человеческих клеток и в мышиных моделях). Выбор исследователей пал на Cre-рекомбиназу (Cre recombinase) бактериофага P1.

P1 — умеренный бактериофаг. Так называют вирусы бактерий, способные к лизогении. Во время лизогенной стадии P1 существует в бактериальной клетке в виде кольцевой молекулы ДНК — плазмиды. Вирусный геном при этом реплицируется, и при делении бактерии ДНК вируса попадает в обе дочерние клетки. При изменении условий вирус может перейти в литическую стадию: в бактериальной клетке образуется множество вирусных частиц, после чего клетка лизируется (разрушается), выпуская вирусное потомство. Вирион (вирусная частица) фага P1 представляет собой икосаэдрическую головку, снабженную сокращающимся хвостом с шестью ножками для посадки вируса на бактериальную клетку (внешне он напоминает бактериофаг Т4). ДНК вируса находится в головке и впрыскивается в клетку при сокращении хвоста. В геноме фага P1 найдено 119 генов (M. F. Gonzales et al., 2022. New Insights into the Structure and Assembly of Bacteriophage P1). Для сравнения: у вируса гриппа А генов всего 8. Внутри вириона ДНК линейная, но при попадании в клетку она замыкается и становится кольцевой. Циркуляризация вирусного генома — работа белка Cre. Сшивание концов ДНК происходит за счет рекомбинации. Белок поэтому и называется Cre — от causing recombination.

Генетическая рекомбинация — разрезание и сшивание молекул ДНК, приводящее к перестановке их участков. В результате рекомбинации может произойти транслокация (участки ДНК меняются местами), инверсия (участок ДНК переворачивается) или делеция (участок ДНК вырезается). Cre-рекомбиназа узнает определенную последовательность нуклеотидов, которая получила название loxP. Чтобы произошла рекомбинация, две молекулы Cre, связавшиеся с одним сайтом loxP, должны встретиться с двумя другими молекулами Cre, связанными с другим сайтом loxP. Это приведет к разрезанию сайтов loxP посередине и обмену получившимися концами.

Рис. 3. Комплекс двух участков loxP с четырьмя молекулами Cre в процессе обмена отрезанными концами. Структура получена методом дифракции рентгеновский лучей. Рисунок с сайта rcsb.org

Cre-рекомбиназа более 30 лет используется в молекулярной биологии. Однако, авторам обсуждаемой статьи было важно использовать специфичность ее связывания с ДНК, а не рекомбиназную активность. Поэтому каталитическая активность белка была устранена введением в ген cre специальных мутаций. Чтобы взамен придать белку Cre функцию транскрипционного фактора, к гену пришили последовательность, кодирующую активаторный домен белка VP16 (для надежности — даже не одну последовательность, а четыре).

VP16 — транскрипционный фактор альфагерпесвирусов, известным представителем которых является вирус простого герпеса. Этот белок попадает в клетку в составе вириона и проникает в ядро вместе с вирусной ДНК. Там он привлекает некоторые клеточные белки, и образующийся комплекс активирует транскрипцию генов на вирусной ДНК. VP16 — очень сильный активатор транскрипции, поэтому его часто используют в генной инженерии (H. Hirai et al., 2012. Structure and functions of powerful transactivators: VP16, MyoD and FoxA).

Испытав разные варианты, авторы статьи получили следующую оптимальную конструкцию: промотор — последовательность из трех сайтов lox71 (аналог loxP с небольшими модификациями) в сочетании с дополнительными регуляторными участками, необходимыми для эффективной транскрипции, и активатор — каталитически неактивная Cre-рекомбиназа, сшитая с последовательностью из четырех активаторных доменов VP16, называемой VP64. Ученые показали, что система имеет низкую базальную активность и высокую эффективность (то есть ген практически не читается с промотора в отсутствие активатора, но при этом транскрипция бодро идет при его добавлении). Базальная активность системы оказалась ниже, а эффективность — выше, чем у системы, основанной на тетрациклине.

Рис. 4. Вверху — схема предложенной в обсуждаемой статье системы контроля экспрессии генов. Внизу — результаты проверки ее в серии экспериментов. Чтобы проверить систему, авторы использовали ее для экспрессии зеленого флуоресцентного белка (GFP) в клеточной культуре. Интенсивность флуоресценции (вертикальная ось) отражает количество производимого белка. Зеленый столбик слева — «положительный контроль» — GFP с сильным конститутивным (то есть не нуждающемся в активаторе) промотором млекопитающих; далее показаны результаты для тетрациклиновой системы и новой системы с одним, тремя и шестью участками lox71 в промоторе. Серые столбики — флуоресценция в отсутствие активатора, оранжевые — при его добавлении. Система с тремя участками lox71 показала наибольшую эффективность при наименьшей базальной активности. Рисунок из обсуждаемой статьи в Cells

Для работы системы контролируемой экспрессии нужно доставить в ядро клетки плазмиду с интересующим геном и стоящим перед ним сконструированным промотором, а затем активировать транскрипцию этого гена, добавив активатор. Пока авторам новой системы удалось транспортировать активатор только в виде плазмид — то есть в клетки попадает не сам активатор, а его ген. Ученые планируют также разработать схему, при которой в клетку для активации промотора будет доставляться готовый белок. Это должно позволить более точно регулировать активацию транскрипции.

Источник: Maxim Karagyaur, Daniyar Dyikanov, Pyotr Tyurin-Kuzmin, Stalik Dzhauari, Mariya Skryabina, Maksim Vigovskiy, Alexandra Primak, Natalia Kalinina, Vsevolod Tkachuk. A Novel Cre/lox71-Based System for Inducible Expression of Recombinant Proteins and Genome Editing // Cells. 2022. DOI: 10.3390/cells11142141.

Галина Клинк