Кодируемый ретроэлементом белок удалось приспособить для транспортировки РНК в клетки

Рис. 1. Белок PEG10 произошел от ретротранспозона, но уже давным-давно «одомашнен»: он закрепился в геноме млекопитающих и даже стал выполнять разные полезные функции. При этом PEG10 сохраняет некоторые черты, указывающие на его происхождение. В частности, он формирует капсидоподобные частицы сферической формы (левое изображение получено при помощи просвечивающего электронного микроскопа и показывает поверхность такой частицы, правое изображение получено при помощи криоэлектронной микроскопии и показывает частицу «на просвет»). Во времена былой активности эти капсидоподобные частицы использовались для защиты вурисной РНК, считанной с него и служащей матрицей для перескока в другое место, от клеточных ферментов и других неблагоприятных факторов. Фото из обсуждаемой статьи в Science

Большинство ферментов, которыми пользуются молекулярные биологи, были когда-то выделены из разных живых организмов. Например, ДНК-полимераза Taq, использующаяся в полимеразной цепной реакции, была позаимствована у термофильной бактерии Thermus aquatius, а многочисленные эндонуклеазы рестрикции были взяты у разных видов бактерий. В геноме человека и других млекопитающих закодирован белок PEG10, который, как показало исследование американских генетиков, может оказаться незаменимым помощником в нелегкой задаче доставки ДНК или РНК в клетки. Белок этот не совсем человеческий: он принадлежит ретротранспозону, который в глубокой древности внедрился в геном кого-то из наших далеких эволюционных предков и так в нем и осел. Ученые обратили внимание на то, что PEG10 способен образовывать капсиды и заключать в них собственную РНК. Им удалось разобраться с тем, как это происходит, и снабдить эти белковые комплексы полезной нагрузкой. Пока что это лишь демонстрация возможностей новой системы транспортировки генетического материала, — но возможности эти многообещающие.

Более 8% человеческого генома составляют остатки так называемых ретроэлементов с длинными концевыми повторами. К ретроэлементам относят участки ДНК, являющиеся ретротранспозонами или эндогенными ретровирусами, — им присуща способность перемещаться по геному. Ретротранспозоны — это мобильные фрагменты генома, в состав которых входит ген, кодирующий обратную транскриптазу — фермент, который синтезирует ДНК на матрице РНК. Когда с ретротранспозона транскрибируется РНК, то она может внутри клеточного ядра переместиться к какому-нибудь другому участку генома, а обратная транскриптаза переведет ее в форму ДНК, которая затем встроится в этот новый участок. Эндогенные ретровирусы в глубокой древности интегрировались в геном какого-то нашего далекого предка, да так в нем и остались (подробнее о них можно прочитать в статье А. Ржешевского Ретровирусы: «пятая колонна» ДНК). Ретровирусы (не только эндогенные) отличаются от ретротранспозонов тем, что их мобильная форма, РНК, упаковывается в белковые капсиды, которые могут переноситься от инфицированной клетки к другим. Попадая в новую клетку, РНК-геном ретровируса подвергается обратной транскрипции и встраивается в геном клетки-хозяина. К числу ретровирусов, в частности, относится печально известный вирус иммунодефицита человека.

В ходе эволюции многие ретротранспозоны со временем «замолкают»: их гены, кодирующие обратную транскриптазу, накопили столько мутаций, что функциональный белок не производится. Замолкание ретротранспозонов происходит на разных этапах эволюционного пути, поэтому некоторые ретротранспозоны, перешедшие к оседлой жизни, присутствуют в геномах разных видов (это почти наверняка означает, что данный ретротранспозон был у общего предка этих видов). Так, общие ретротранспозоны есть у всех млекопитающих (см. Прочтение генома опоссума доказало ключевую роль транспозонов в эволюции млекопитающих, «Элементы», 13.05.2007), более того, некоторые из них даже стали выполнять важные функции в своем новом пристанище — например, участвовать в формировании плаценты (см. Древние млекопитающие заразились плацентой, «Элементы», 15.12.2005).

Некоторые молекулярные свидетельства былой мобильной природы осевших ретротранспозонов все же сохранились. В частности, и ретровирусы, и ретротранспозоны содержат ген gag (сокращение от group-specific antigen), кодирующий так называемый коровый структурный белок. Белок gag связывает геномную РНК ретровируса (или РНК ретротранспозона), в форме которой он путешествует от одной клетки к другой (или от локации в геноме к другой, соответственно), и защищает ее от неблагоприятных воздействий и клеточных ферментов. Некоторые ретровирусы, давным-давно осевшие в геноме человека, сохранили и ген env, кодирующий белок оболочки (см. статью А. Маркова Данные сравнительной геномики проливают свет на происхождение ретровирусов). Когда-то он входил в состав вирионов ретровирусов, однако после перехода к оседлой жизни необходимость в формировании вирусных частиц отпала, и в некоторых случаях ретровирусные белки «поступили на службу» организму, в геном которого они встроились. Белок PEG10, который выполнял функции белка gag у некого древнего ретротранспозона, а также белки, синтезируемые с генов env некоторых осевших ретровирусов, как раз и стали теми важными функциональными элементами формирования плаценты. В частности, белки синцитины, необходимые для слияния клеток при образовании плаценты, произошли от белков оболочки древних ретровирусов.

Примечательно, что, несмотря на кардинально новые функции, некоторые «одомашненные» гомологи структурных белков ретроэлементов сохранили способность связывать РНК и даже по старой памяти формировать капсиды! Связывание РНК при этом весьма специфично, ведь для белков ретроэлементов важно «поймать» именно РНК своего ретротранспозона или ретровируса, а не случайную РНК из многих тысяч, присутствующих в клетке. Чем не идеальный инструмент для программируемой доставки РНК?

Именно так и решил коллектив ученых из Массачусетского технологического института и других научных организаций США под руководством Евгения Кунина и Фэна Чжана. Им удалось «приручить» уже упоминавшийся белок PEG10, который умеет связывать собственную РНК и упаковывать ее в капсиды. Исследователи смогли добиться, чтобы PEG10 связывал ту РНК, которую они захотят, а затем — чтобы в составе капсидов она доставлялась в клетки.

Идея использования вирусных частиц для доставки чего-нибудь полезного в клетки далеко не нова. Например, одним из самых перспективных векторов для генной терапии является аденоассоциированный вирус. Однако авторы обсуждаемой работы впервые смогли на основе капсидов сделать высокоспецифичный инструмент для доставки строго конкретной РНК. Как же им это удалось?

Из предыдущих исследований было известно, что в геномах млекопитающих имеется множество гомологов гена gag, причем многие из них способны к формированию капсидоподобных структур, которые выделяются из клетки в составе мембранных пузырьков — внеклеточных везикул. Авторы наработали мышиный PEG10 и некоторые другие гомологи gag, сохранившиеся в геноме мыши, в клетках кишечной палочки и показали, что они, действительно, формируют капсиды, зачастую сферические (рис. 1). Более того, оказалось, что частицы из PEG10 действительно выделяются клетками млекопитающих в составе везикул.

Ученые показали, что активация транскрипции мышиного Peg10 в культуре клеток приводит к тому, что во фракции вирусоподобных частиц, выделенных из культуральной среды, накапливается существенное количество полноразмерной мРНК Peg10. Клетки, у которых активирован Peg10, помимо множества метаболитов и разнообразных мембранных пузырьков выделяют в среду, в которой они растут, везикулы, содержащие капсиды из белка PEG10 и ряда других белков ретровирусов. Именно фракцию везикул, содержащую эти псевдовирусные частицы, и исследовали ученые. Хотя в других исследованиях ранее было показано, что в клетках трофобласта, задействованных в образовании плаценты, белок PEG10 связывает ряд мРНК, в том числе и свою, авторы новой работы показали, что именно собственная мРНК Peg10 попадает в состав капсидов и секретируется клетками наружу в форме внеклеточных везикул.

Белок PEG10 содержит два домена, которые, как предполагается, отвечают за связывание нуклеиновых кислот. Авторы исследования показали, что экспорт мРНК Peg10 зависит от наличия одного из них, и делеция этого домена приводит к существенному падению в количестве мРНК Peg10, экспортируемой клетками в составе везикул. Но какие участки в самой РНК необходимы для того, чтобы PEG10 ее связал? Ученые показали, что PEG10 связывает определенные последовательности в 5'-нетранслируемой области и в начале 3'-нетранслируемой области (точнее, первые 500 нуклеотидов 3'-нетранслируемой области) в собственной мРНК. Следовательно, если для успешного распознавания PEG10 своей мРНК-мишени ее кодирующая последовательность не играет роли, то белку можно «подсунуть» кодирующую область от любой другой РНК, окруженную нужными последовательностями с обоих концов, — он распознает ее и упакует в свои капсиды. Остается лишь экспериментально подтвердить возможность такого «обмана» PEG10.

Авторы работы разработали довольно замысловатую систему, позволяющую понять, может ли произвольная РНК, содержащая 5'-нетранслируемую область и начальный участок 3'-нетранслируемой области мРНК Peg10, быть связана белком PEG10, упакована в капсиды и секретирована в составе везикул, которые доставят ее в клетки-реципиенты. Они воспользовались системой Cre-loxP, состоящей из рекомбиназы Cre, которая узнает и вырезает участок ДНК, на концах которого располагаются специальные последовательности, обозначаемые как loxP. Ученые поместили последовательность, кодирующую рекомбиназу Cre, между необходимыми последовательностями нетранслируемых областей гена, кодирующего PEG10, в составе вектора — кольцевой плазмиды. Полученная генетическая конструкция была введена в клетки совместно с вектором, кодирующим белок оболочки вируса везикулярного стоматита, и вектором, кодирующим PEG10 (рис. 2). Белок вируса везикулярного стоматита выступал в роли фузогена, то есть агента, запускающего перестройки клеточной мембраны и отпочковывание везикул от нее. В результате в клетках, получивших все три вектора, образовывались внеклеточные везикулы, содержащие капсиды из белка PEG10, в которых находилась мРНК с нетранслируемыми областями от мРНК Peg10, между которыми была заключена область, кодирующая рекомбиназу Cre.

Рис. 2. Схема работы системы SEND. В клетки вводятся три вектора, кодирующие белок-фузоген, PEG10 и РНК-груз, причем в составе груза кодирующая последовательность, соответствующая РНК, которую требуется перенести, окружена элементами, необходимыми для ее распознавания белком PEG10: 5'-нетранслируемой областью и начальным участком 3'-нетраслируемой области Peg10. В клетках с вектора синтезируется PEG10, он распознает свою РНК-мишень, упаковывает ее в капсид, который благодаря фузогену далее попадает в мембранные пузырьки — везикулы. Если эти везикулы добавить к другим клеткам, то после слияния везикул с мембраной клетки-реципиенты получат РНК-мишень в целости и сохранности. Рисунок из обсуждаемой статьи в Science

Когда полученные везикулы были добавлены к клеткам, имеющим ген зеленого флуоресцентного белка (GFP) с сайтом loxP внутри, то после слияния везикул с клетками-реципиентами в цитоплазме последних начиналась трансляция привнесенных вместе с везикулами мРНК, кодирующих рекомбиназу Cre. Рекомбиназа Cre узнавала последовательность loxP в гене, кодирующем GFP, и вырезала ее, восстанавливая нормальный ген GFP, с которого синтезировался полноценный белковый продукт. Таким образом, появление зеленой флуоресценции в описанной системе служит сигналом успешного переноса РНК в капсиде из PEG10 от одних клеток к другим (рис. 3). Описанная система получила название SEND (Selective Endogenous Encapsidation for Cellular Delivery). Схожие результаты были получены и с человеческим белком PEG10. Для успешного распознавания РНК ему, как и мышиному PEG10, достаточно наличия в ней последовательности 5'-нетранслируемой области и первых 500 нуклеотидов 3'-нетранслируемой области собственной мРНК Peg10.

Рис. 3. Подтверждение работы системы SEND с помощью Cre-LoxP. Если клетки-реципиенты, в которых есть ген GFP с сайтом loxP внутри, успешно получают РНК, кодирующую рекомбиназу Cre, с помощью системы SEND, то в них происходит наработка белка Cre. Cre вырезает последовательность loxP и восстанавливает нормальный ген GFP, в результате чего в клетках появляется зеленая флуоресценция (слева). В центре: в геном клеток в составе лентивирусного вектора был внедрен ген, кодирующий рекомбиназу Cre, которая активирует ген GFP. Справа: клетки получили частицы PEG10, которые не содержат кодирующую Cre РНК, поскольку в клетках-упаковщиках частиц PEG10 ген, кодирующий Cre, не был обрамлен необходимыми нетранслируемыми областями (UTR). Так как в клетках нет активного белка Cre, ген GFP не экспрессируется и зеленой флуоресценции нет. Рисунок из обсуждаемой статьи в Science

В описанной версии системы SEND есть один важный недостаток: в качестве фузогена в ней используется экзогенный белок — белок оболочки вируса везикулярного стоматита. А можно ли создать полностью эндогенную систему для доставки РНК, все компоненты которой были бы закодированы в собственном геноме клетки? Оказалось, что в качестве фузогена можно без потери эффективности использовать мышиный синтицин A — еще один белок, происходящий от «одомашненного» гена ретроэлемента, но не gag, как в случае с PEG10, а env. Таким образом, SEND можно сделать полностью эндогенной системой для доставки РНК.

В заключение стоит добавить, что белок PEG10 помимо описанных выше процессов участвует и в развитии нервной системы, причем, похоже, PEG10 в этом случае играет роль стабилизатора для РНК: как показали авторы работы, в развивающихся нейронах коры PEG10 может связывать и стабилизировать около полусотни РНК, включая свою собственную. Но ведь в созревающих нейронах также может экспрессироваться синтицин A, и теоретически они даже могут обмениваться друг с другом транскриптами посредством везикул, в которых находятся капсиды из PEG10 в комплексе с РНК. Так это или нет, пока остается неизвестным. Если нейроны действительно обмениваются РНК в составе псевдовирусных частиц в ходе созревания, то это свидетельствует о существовании принципиально нового уровня регуляции формирования нервной системы — регуляции за счет «общения» молодых нейронов с помощью РНК.

Источник: Michael Segel, Blake Lash, Jingwei Song, Alim Ladha, Catherine C. Liu, Xin Jin, Sergei L. Mekhedov, Rhiannon K. Macrae, Eugene V. Koonin, Feng Zhang. Mammalian retrovirus-like protein PEG10 packages its own mRNA and can be pseudotyped for mRNA delivery // Science. 2021. DOI: 10.1126/science.abg6155.

Елизавета Минина