Системы типа CRISPR-Cas9 широко распространены и имеют множество вариантов

Рис. 1. Филогенетическое дерево семейства эндонуклеаз IscB — новых героев в истории о системе CRISPR-Cas. IscB (эндонуклеазы транспозонов) берут начало от группы IsrB с одним эндонуклеазным доменом (от которых с приобретением второго домена происходит множество разнообразных IscB). Рядом с ними всегда имеется особая последовательность некодирующей РНК, направляющая эндонуклеазный надрез. Эта РНК была приобретена на ранних этапах становления этой системы рибонуклеопротеинов, так как она обнаружена у подавляющего большинства представителей IscB (красная полоса). В локусах IsrB и IscB иногда появляются независимо цепочки некодирующей РНК «повтор-спейсер-повтор», аналогичный CRISPR (черные кружочки). От одной из линий берет начало Cas9, снабженный собственной сменной кассетой CRISPR. Рисунок из обсуждаемой статьи в Science

Коллектив американских генетиков исследовал свойства и работу эндонуклеаз, родственных Cas9. Эти эндонуклеазы, разрезающие двойные цепочки ДНК, связываются с кусочками особой РНК, направляющей фермент точно к месту назначения. По существу, система с участием этих эндонуклеаз функционирует примерно так же, как и CRISPR-Cas9, и в ней направляющая РНК тоже может менять таргетные участки, меняя «адрес» доставки эндонуклеазы. Такие комплексы «РНК + эндонуклеаза» расположены на транспозонах. Важно, что они чрезвычайно широко распространены у микроорганизмов, что указывает на их востребованность в работе генома. Это целое явление, о котором пока почти ничего не известно.

Работа информационных молекул в клетке — ДНК или РНК — требует чрезвычайной точности: нужно вовремя включать и выключать производство колоссального разнообразия белков, причем каждого в определенном количестве, и все время отслеживать поломки в цепочках нуклеотидов и быстро чинить их. Для этого в клетке наработано великое множество различных регуляторов трансляции, транскрипции, репарации. Среди них сейчас особый интерес прикован к системе CRISPR-Cas, так как она способна не только останавливать транскрипцию нежелательных фрагментов вирусной ДНК, встроенной в геном, но и определять, какие из фрагментов являются нежелательными на текущий момент, и выбрасывать их из генетической последовательности.

CRISPR-Cas — система приобретенного иммунитета бактерий и архей, которая работает за счет встраивания в CRISPR-последовательность («повтор-спейсер-повтор-спейсер-...») череды других спейсеров, представляющих собой кусочки вирусных ДНК. Далее при «комплементарном» распознавании этих кусочков спейсерным участком РНК включаются молекулярные ножницы — эндонуклеаза Cas9 (и родственные ей эндо- и экзонуклеазы). Эндонуклеазы вырезают вредоносный фрагмент, и вирусная частица не воспроизводится клеткой. Кусочки вирусных ДНК (спейсеры) в последовательности CRISPR сменные, они добавляются при встрече с новой инфекцией и убираются, если клетка с той или иной инфекцией давно не сталкивалась. В последовательность CRISPR можно вставить любой кусочек РНК, и тогда из ДНК будет вырезаться комплементарный (таргетный) фрагмент. В 2020 году за открытие, изучение и отлаживание искусственных систем CRISPR была присуждена Нобелевская премия; подробнее об истории изучения этой системы и о механизме ее работы см. в новости Нобелевская премия по химии и медицине — 2020, «Элементы», 12.10.2020.

Ясно, что это только самое начало большой истории о том, как геном может оперативно среагировать на вызов окружающей среды — просто сменить «кассету». Но что это за системы со сменной таргетной «кассетой», откуда они взялись у бактерий и архей, и как формировались? При нынешнем прагматическом подходе, преобладающем в науке, ответы на эти вопросы связывают с возможностью биотехнологическими методами корректировать мутации у человека, а также выводить новые сорта для сельского хозяйства. Но в действительности перспективы простираются существенно дальше практических задач — нам важно понять, как устроен геном живых существ, и как эта сложнейшая информационная и операционная система может подстраиваться к окружающей среде.

Фундаментальные исследования позволили понять, что системы CRISPR-Сas произошли от транспозонов, потерявших мобильность и закрепившихся в геноме (V. Kapitonov et al., 2016 ISC, a Novel Group of Bacterial and Archaeal DNA Transposons That Encode Cas9 Homologs). Это стало ясно после поиска гомологов генов Cas9. Такие гомологи содержат два домена эндонуклеаз, разрезающих одну или обе последовательности двойной цепочки ДНК. Это домены обозначаются HNH и RuvC, причем последовательность первого вставлена в последовательность второго. У гомологичных генов имеются признаки происхождения от транспозонов (терминальные палиндромы и таргетные места вставок). Гомологи Cas9 образуют четкий кластер при построении филогенетического дерева, который был назван IscB (Isc — сокращение от insertion sequences Cas9-like, буква B означает, что это аналог транспозазы TnpB). Белки Cas ответвляются от этого семейства единым кластером. Отсюда ясно, что эндонуклеазы Cas произошли от какого-то одного представителя семейства транспозонов, несущих эндонуклеазу IscB.

Опубликованная недавно в журнале Science статья посвящена изучению этих гомологов. Казалось бы, это узкоспециальная тема, но она неожиданно вывела ученых в совершенно новую область геномики — в область управляемых систем редактирования генома. И знаменитая система CRISPR-Cas оказалась частным случаем таких систем. Эту интереснейшую и важную работу выполнила группа ученых и студентов под руководством Фэна Чжана (Feng Zhang), представляющая несколько лабораторий MIT.

Рис. 2. Схема строения эндонуклеаз IscB и Cas9: последовательность IscB начинается с уникального для этой группы консервативного мотива PLMP, затем следуют домены эндонуклеаз RuvC (II и III) со вставкой HNH и мостиком B, а заканчивается все терминальным мотивом C. Общая длина последовательности — 429 аминокислот. Функция этих систем не известна (что символизирует квадрат со знаком вопроса). Cas9 состоит из RuvC c теми же вставками, что и IscB. Активные сайты связывания у обоих белков одинаковые, а вот терминальные и стартовые мотивы у них разные. Функция Cas9 связана с работой CRISPR-Cas системы. Рисунок из обсуждаемой статьи в Science

Для начала ученые тщательно просмотрели базы данных в поисках генов IscB, ассоциированных с CRISPR. Считалось, что IscB с CRISPR никак не ассоциированы, однако такая связь все же выявилась. Для некоторых последовательностей IscB нашлись такие, рядом с которыми считывались последовательности CRISPR (это 16 кластеров IscB из 603 и соответственно 31 последовательность из 2811). Иными словами, рядом с геном эндонуклеазы IscB располагается фрагмент, содержащий последовательность «повтор-спейсер-повтор».

Чтобы изучить этот комплекс, подозрительно похожий на CRISPR-Cas9, ученые сконструировали его последовательность и внедрили в геном кишечной палочки E. coli. Бактерия честно произвела не только сам белок IscB, но и РНК, прилегающую к кодирующей последовательности. Эта некодирующая РНК, как выяснилось, прикреплялась затем к самой эндонуклеазе IscB. А чтобы сходство с CRISPR-Cas9 стало еще четче, были проверены рабочие свойства системы «некодирующая РНК + IscB». Эксперименты показали, что этот комплекс действительно разрезал последовательность ДНК точно там, где некодирующая РНК комплементарно соединялась с предъявленным ДНК-фрагментом.

Исследователи задались вопросом, что это за интересный кусочек некодирующей РНК. Для этого они сравнили 563 локуса, содержащие различные IscB. И оказалось, что перед или за последовательностью самой IscB всегда находится особый участок некодирующей РНК длиной в 300 нуклеотидов. Он получил наименование ωРНК. В нем одна часть — консервативная, вторая — изменчивая. Если в пробирке смешать эндонуклеазу IscB и эту ωРНК, то образуется рибонуклеопротеиновый комплекс, который будет резать ДНК там, куда его направит ωРНК своим изменчивым концом. А консервативный ее конец мгновенно образует петли для соединения с белком. Такой эксперимент был с успехом проделан — молекулярные ножницы, направленные к цели ωРНК, прекрасно сработали.

Выходит, не только CRISPR-Cas9 способна к таргетному редактированию цепочек ДНК, но и рибонуклеопротеиновые комплексы ωРНК-IscB, привнесенные в геном транспозонами. Это открытие позволило авторам говорить об общей «репрограммируемой эндонуклеазной активности», которую несут белки семейства IscB и их потомки CRISPR-Cas9. Комплекс CRISPR-Cas по своим оперативным характеристикам оказался близким к эндонуклеазам в транспозонах. Эти связки вида «эндонуклеаза + направляющая РНК» в транспозонах получили наименование OMEGA (Obligate Mobile Element Guided Activity — это можно перевести как «строго управляемая активность мобильных элементов»).

Возможности для перепрограммирования в системе CRISPR-Cas9 заложены в изменчивой череде повторов и спейсеров. В системе OMEGA (ωРНК + IscB) перепрограммирование также может осуществляться за счет встраивания ωРНК между CRISPR последовательностью и IscB, но еще за счет пристраивания нескольких различных ωРНК к IscB, за счет дублирования всего комплекса ωРНК-ISCB. Также встречаются и отдельные ωРНК, они располагаются в транс-положении по отношению к IscB. Этот последний случай открывает огромные возможности для маневрирования ωРНК, так как место вставки определено весьма нестрого.

Происхождение системы OMEGA ученые связывают с эндонуклеазой, похожей на IscB, но лишенной вставки HNH в домен RuvC. Этот вариант получил наименование IsrB, и он, очевидно, имеет меньшую длину, чем IscB. IsrB, как и IscB, имеет рядом направляющую ωРНК. Так что и этот комплекс обладает свойством надрезать цепочку ДНК в требуемой позиции. Помимо него нашлись и другие белки, функционально и по строению сходные с IscB. Ими оказались гены транспозаз TnpB, которые так же, как и IsrB, включают домен RuvC. Данные белки образуют кластер внутри семейства, от которого, как показывает филогенетический анализ, произошли все IscB, а от них — Cas. Важно, что по соседству с TnpB обнаружились и участки последовательностей некодирующей РНК. В экспериментах было показано, что эти РНК, аналогично ωРНК, адресно направляют активность TnpB. Так что и связку ωРНК-TnpB тоже причислили к группе OMEGA. А чтобы масштабы явления стали более отчетливы, следует упомянуть, что в бактериальном геноме гены TnpB и IscB исключительно многочисленны и разнообразны (число генов TnpB может достигать миллиона, с сотней копий тех или иных вариантов). Так что способность прицельно редактировать и/или вставлять фрагменты в нуклеотидную последовательность широко используется микроорганизмами.

Назначение этой, как выяснилось, весьма обычной способности пока мало понятно. Возможно, с этими комплексами связана адаптация организмов, защита от патогенов и токсинов, репарация генома или что-то еще. Рассуждать пока рано, но ясно, что за этим явлением скрывается колоссальный пласт новых знаний о геноме.

Источник: Han Altae-Tran, Soumya Kannan, F. Esra Demircioglu, Rachel Oshiro, Suchita P. Nety, Luke J. McKay, Mensur Dlakić, William P. Inskeep, Kira S. Makarova, Rhiannon K. Macrae, Eugene V. Koonin, Feng Zhang. The widespread IS200/605 transposon family encodes diverse programmable RNA-guided endonucleases // Science. 2021. DOI: 10.1126/science.abj6856.

Елена Наймарк