Для усложнения строения грудных плавников данио-рерио достаточно замены одного нуклеотида

Рис. 1. Схема, отражающая современное понимание эволюции скелета грудных плавников рыб и передних конечностей четвероногих позвоночных. Цветом выделены длинные кости, представленные во внутреннем скелете животных. Словом rephaim авторы работы обозначили рыбок-мутантов, которых они изучали. Строение скелета древних рыб, являвшихся общими предками современных рыб и наземных позвоночных, теоретически выводится на основании сравнительной анатомии современных позвоночных, а также ископаемых видов рыб. Рисунок из обсуждаемой статьи в Cell

Конечности четвероногих — замечательное приспособление, сыгравшее колоссальную роль в освоении суши позвоночными. Превращение плавников в конечности было связано с постепенным усложнением их структуры. В ходе широкомасштабного скрининга ученые из США неожиданно обнаружили две мутации, каждая из которых приводит к появлению дополнительных длинных костей в грудных плавниках у рыбок Danio rerio. Более того, эти новые кости образуют суставы с соседними костными элементами и интегрируются с мышечной тканью. Мутации затронули гены vav2 и wasl. Результатом мутаций становится усиление экспрессии гена hox11 в зачатках плавников, что, в свою очередь, приводит к появлению дополнительных костей и суставов. Эти же гены важны и для нормального развития предплечья у мышей. Особенно поражает тот факт, что одна мутация оказалась способна вызвать скачкообразное усложнение (а не упрощение, как это бывает гораздо чаще) структуры тела. Это показывает наличие скрытого потенциала к усложнению в программе развития плавников, и похоже на то, что этот потенциал как раз и был реализован в ходе эволюции древних рыб, позволив позвоночным, в конце концов, освоить наземную среду.

Конечности наземных позвоночных эволюционно возникли как результат преобразования плавников рыб. Ноги, руки и лапы представляет собой достаточно сложные устройства, имеющие в своей структуре множество костей, соединяющихся друг с другом при помощи суставов. В движение они приводятся при помощи определенным образом прикрепленных к костям мышц, снабженных кровеносными сосудами и нервными окончаниями. Ход эволюции плавников и история их превращения в конечности четвероногих представляет большой интерес для исследователей.

Рыбы делятся на несколько групп, устройство плавников в которых имеет заметные различия. У ученых есть определенное представление о том, каким путем происходили преобразования одних вариантов скелета в другие — схематично ход этих превращений отображен на рис. 1. Как можно видеть, структура скелета общего предка всех костных рыб и их четвероногих потомков уже достаточно сложная: в ней выделяется три части в направлении от переднего к заднему краю (про-, мезо- и метаптеригиум), причем метаптеригиум также расчленяется на несколько элементов от проксимального (ближнего к телу) к дистальному (дальнему от тела) концу.

Группа костистых рыб включает около 30 000 видов. У всех этих видов скелет грудных плавников устроен принципиально по одному и тому же плану. Основу внутреннего скелета плавника составляют несколько (обычно 4) длинных косточек, называемых проксимальными радиалиями, лежащие бок о бок друг с другом, которые своим проксимальным концом образуют сочленение с плечевым поясом. На противоположном — дистальном — конце к ним примыкают мелкие округлые косточки, именуемые дистальными радиалиями, а к тем крепятся костные лучи, образующие наружный скелет собственно лопасти плавника. Передние конечности наземных позвоночных, принципиально отличаются — для всех представителей четвероногих животных характерна трехчастная структура, где в направлении проксимально-дистальной оси последовательно располагаются плечевая кость (образующая сочленение с плечевым поясом), затем две длинных кости предплечья (локтевая и лучевая) и, наконец, кисть.

В скелете плавников лопастеперых рыб, которые, собственно, дали начало четвероногим (на это указывают как ряд анатомических черт, включая парные легочные мешки, так и данные геномики) наблюдается многочастная структура: вдоль проксимально-дистальной оси следуют несколько длинных костей, из которых лишь самая проксимальная крепится к плечевому поясу. Как показано на рис. 1, зоологам представляется, что строение скелета плавников костистых рыб — результат упрощения, а строение скелета конечностей — результат усложнения по отношению к скелету общего предка лучеперых и лопастеперых рыб.

С другой стороны, сложный скелет общего предка тоже должен был сформироваться в ходе предшествующей эволюции из более простого. Об этих ранних этапах мы не имеем вполне ясного представления.

Как именно на уровне генетических механизмов и их эволюционных изменений была опосредована эволюция скелета плавников — одна из интригующих загадок для специалистов в области эволюционной биологии развития (evo-devo). Решением этих вопросов активно занимаются многие лаборатории в разных странах и достаточно регулярно появляются новые публикации. Одной из недавних публикаций на эту тему и посвящена наша новость.

Толчком к работе стало курьезное появление очень необычных мутантов в масштабном скрининговом исследовании на рыбках Danio rerio, выполненном в лаборатории Мэттью Харриса (Matthew Harris lab) на базе Гарвардской медицинской школы. Целью скрининга было выявление генов, важных для разных аспектов морфогенеза у позвоночных. Для этого у рыбок индуцировали мутагенез и затем анализировали возникающие дефекты развития.

Чтобы получить мутантов, в аквариумы, где содержались самцы, добавляли мутагенное вещество этилнитрозомочевину, действие которого приводило к повышению количества мутаций в сперматозоидах. Некоторые из этих мутаций затрагивали гены, важные для эмбрионального развития, — такие мутации могут приводить к отклонениям в развитии и появлению новых фенотипических признаков. Самцов скрещивали с самками, не подвергавшимися мутагенезу, в результате получалось гетерозиготное потомство. Дальнейшие серии скрещиваний позволяли выявить новые наследуемые фенотипы и характер их наследования.

Внимание ученых привлек особенно необычный мутантный фенотип: у некоторых рыб в грудных плавниках появлялись дополнительные вставочные длинные косточки вдоль проксимально-дистальной оси (рис. 2), которые не крепились непосредственно к плечевому поясу, а располагались дистально за радиалиями. Такие мутанты появились независимо дважды, фенотип в обоих случаях наследовался по доминантному типу.

Рис. 2. Анатомия и ход развития скелета плавника у рыб с «диким типом» (wild type) и у мутантов (rephaim). А — фото скелета плавника рыб дикого типа и соответствующая схема строения. Зеленым выделены проксимальные радиалии (proximal radials). Б — фото и схема скелета плавников у мутантов. Сиреневым показаны новообразованные вставочные радиалии (intermediate radials). В — ход развития скелета плавников у рыбок дикого типа (верхний ряд) и у мутантов (нижний ряд). На фото показаны стадии, соответствующие 3, 4 и 5 неделям от оплодотворения икринки (wpf — weeks post fertilization). Голубым цветом окрашены хрящи, красноватым — кости. Видно, что у мутантов сначала формируется длинный хрящ, на месте которого затем образуются две косточки, между которыми впоследствии формируется сустав (на месте стрелки). Рисунок из обсуждаемой статьи в Cell

Последовательное отслеживание эмбриогенеза показало, что сначала образуется цельная хрящевая «заготовка», внутри которой формируются два очага минерализации, превращающиеся в две длинные косточки — проксимальную и вставочную радиалии, соединенные между собой полноценным суставом (рис. 2).

Вставочные радиалии имели сложное строение, характерное для длинных костей конечностей. С двух концов имелись эпифизы, на внешних поверхностях которых формировались полноценные суставы с синовиальными сумками, сочленяя вставочные косточки с соседними, а в надкостницу прорастали кровеносные сосуды. Более того, эти кости были соединены с другими костными элементами при помощи мышц, как показано схематически на рис. 3. В статье приводятся качественные гистологические препараты, которые позволяют при желании воочию убедиться в объективности всех этих утверждений.

Рис. 3. Схема крепления мышц в плавниках у данио-рерио дикого и мутантного типов, а также в конечностях четвероногих. У рыбок дикого типа нет мышц, которые бы крепились к проксимальным радиалиям. У мутантов к проксимальным радиалиям мышцы также не крепятся, а вот новообразованные вставочные радиалии связываются мышечными волокнами как с плечевым поясом (shoulder), так и с плавниковыми лучами (fin rays). В итоге мускулатура плавника оказывается существенно усложнена и становится более схожей с мускулатурой конечности четвероногого. Рисунок из обсуждаемой статьи в Cell

Проведя секвенирование (анализ последовательности) генетического материала, ученые установили точную локализацию мутаций. Выяснилось, что в обоих случаях мутантный фенотип был обусловлен заменой одного единственного нуклеотида. Однако мутация затрагивала два разных гена: в одном случае был затронут ген vav2, в другом случае — ген wasl. Обе мутации были несинонимичными — они приводили к замене одной аминокислоты в соответствующем белке. Интересно, что ранее ни один из этих двух генов не был известен как участник регуляции развития плавников рыб. Более того, когда ученые искусственно отключили эти гены, внеся при помощи системы CRISPR/Cas9 делеции выше места нахождения мутации — строение плавников у рыб оказалось совершенно обычным. Выходит, мутации, вызвавшие новый фенотип, привели не к утрате функций белками, а к приобретению какой-то новой функции. Это согласуется и с тем фактом, что мутации демонстрировали доминантный характер наследования (то есть признак проявлялся у особей не только с гомозиготным, но и с гетерозиготным генотипом). Авторы, между тем, отмечают, что у рыбок, несущих мутацию в гомозиготном состоянии, часто наблюдались комплексные нарушения многих признаков фенотипа, причем с разной степенью выраженности, так что далее работали только с гетерозиготными особями.

О внутриклеточных функциях вышеназванных генов известно, что белок, кодируемый геном vav2, участвует в регуляции работы G-белков (эта группа белков, в свою очередь, регулирует множество разнообразных внутриклеточных процессов), а белок, кодируемый геном wasl, необходим для формирования актиновых филаментов цитоскелета. Экспрессия обоих генов обнаружилась в зачатках плавников у эмбрионов Danio rerio. Отдельная серия экспериментов с направленным отключением генов (при помощи все той же системы CRISPR/Cas9) позволила выяснить, что эти два гена являются частью одного и того же сигнального пути в регуляции развития плавников, где vav2 является вышестоящим регулятором по отношению к wasl. Если мутантный vav2 активен, а ген wasl искусственно отключают, то развиваются рыбы с обычным фенотипом. Если же наоборот, сохраняется мутантный wasl, а отключается ген vav2, то получается аномальный фенотип.

Исходя из того, что известно о структуре белка wasl, мутация, вероятно, повлияла на процессы аутоингибирования и внутриклеточной локализации этого белка. Изменение внутриклеточной локализации показали и дополнительные эксперименты, проведенные авторами исследования на модельной клеточной линии HeLa: немутантная версия белка была сосредоточена преимущественно в ядре клетки, а мутантная — в цитоплазме.

Понять, какие части скелета гомологичны друг другу в строении плавников и конечностей, помогает изучение экспрессии известных генов-дирижеров онтогенеза, среди которых особенно знамениты Hox-гены. Так, было обнаружено, что развитие кожных лучей лопасти плавника костистых рыб зависит от гена Hoxd13, — и от него же зависит нормальное развитие скелета кисти — то есть самой дистальной части скелета передней конечности. Отсюда можно сделать предположительный вывод о гомологии скелета кисти и лопасти плавника.

Логичным шагом было проверить, как изменяется у мутантов экспрессия Hox-генов в той части плавника, где формируются вставочные длинные косточки. Проверка не подвела: в зачатке плавников мутантов оказалась повышена экспрессия гена Hoxd11a, а искусственное отключение этого гена у мутантов по генам vav2 или wasl приводило к восстановлению обычного фенотипа. И, с другой стороны, экспериментальное отключение генов wasl либо Hoxd11 вызывает у мышей аномалию в развитии предплечья! Напрашиваются очень любопытные выводы: мутация как бы воспроизводит вычленение в структуре скелета плавника Danio rerio «плеча» и «предплечья».

Рис. 4. Зоны экспрессии Hox-генов в разных частях плавников у рыбок дикого типа и у мутантных рыбок, а также в конечности четвероногого. Ген Hox11, который «отмечает» предплечье в скелете конечности, также усиленно экспрессируется во вставочных радиалиях у мутантов. В то же время, плавниковые лучи в скелете рыб, как и кости кисти, «отмечены» экспрессией гена Hox13. Рисунок из обсуждаемой статьи в Cell

Насколько близко воспроизводит наблюдаемый здесь феномен эволюционный сценарий? Не следует чрезмерно увлекаться в выводах. Сами же авторы указывают, что затронутые мутациями позиции чрезвычайно консервативны: в белках у всех позвоночных в этих позициях размещаются одинаковые аминокислоты. То есть повышенная экспрессия wasl и hoxd11, необходимая для формирования предплечья, обеспечивается какими-то иными регуляторными механизмами.

И все же, есть основания предполагать, что сходства в механизме эмбрионального развития конечностей четвероногих и сложного скелета плавника у мутантов Danio rerio выявились неспроста. Авторы интерпретируют наблюдаемые у мутантов преобразования как реализацию «скрытого потенциала развития», содержащегося в системе регуляции эмбрионального развития парных придатков рыб, который, вероятно, был реализован в ходе эволюции древних позвоночных. В обсуждении своих результатов они приводят цитату из «Происхождения видов» Дарвина: «Если ранее утраченный признак вновь возникает спустя многие поколения, то наиболее правдоподобной гипотезой будет не то, что у потомков внезапно пробуждается признак их давних предков, но что они сохраняют тенденцию к развитию рассматриваемого признака, которая реализует себя в неких новых благоприятствующих условиях» („When a character which has been lost in a breed, reappears after a great number of generations, the most probable hypothesis is, not that the offspring suddenly takes after an ancestor some hundred generations distant, but that in each successive generation there has been a tendency to reproduce the character in question, which at last, under unknown favorable conditions, gains an ascendancy“).

Это исследование подталкивает вновь обратиться к концепции «перспективных монстров», предложенной Рихардом Гольдшмидтом в 30-х годах XX века: мы возвращаемся к вопросу о том, может ли в некоторых случаях единичная мутация создать серьезную инновацию (усложнение) через преобразование процессов развития и тем самым дать основание совершенно новой группе организмов с принципиально отличающимся от родственных групп планом строения тела (по этой теме см. обзор И. Ю. Попова Монстры в эволюции).

Источник: M. Brent Hawkins, Katrin Henke, Matthew P. Harris. Latent developmental potential to form limb-like skeletal structures in zebrafish // Cell. 2021. DOI: 10.1016/j.cell.2021.01.003.

Об эволюции конечностей см. также:
1) Темп редукции пальцев у архозавров зависит от генов, регулирующих эмбриональное развитие, «Элементы», 17.10.2013.
2) Новооткрытые рыбьи гены помогли понять, почему первые четвероногие были многопалыми, «Элементы», 09.07.2010.
3) Длинные плавники скатов — результат добавления новой точки роста, «Элементы», 22.12.2015.

Татьяна Романовская