Искусственные полимеры могут хранить генетическую информацию

Рис. 1. ДНК и ксенонуклеиновые кислоты (КНК). А — структура ДНК (показана одна из двух нитей, образующих двойную спираль). B — структура мономеров (нуклеотидов) ДНК (DNA) и шести КНК. Молекулы различаются строением сахара, входящего в состав сахаро-фосфатного «скелета». У ДНК это дезоксирибоза, у РНК — рибоза, у КНК — разные другие сахара: арабиноза (ANA), 2'-флюороарабиноза (FANA), треоза (TNA), особая «запертая» (locked) форма рибозы (LNA, см. Locked nucleic acid), циклогексен (CeNA), ангидрогекситол (HNA). Base — азотистое основание. Черные шарики — атомы углерода, красные — кислорода, зеленые — фтора. Изображение из обсуждаемой статьи G. F. Joyce в Science

Получены ферменты-полимеразы, способные переписывать генетическую информацию с молекул ДНК на шесть типов не встречающихся в природе полимеров — «ксенонуклеиновых кислот» (КНК). Другие искусственные ферменты осуществляют обратный процесс — синтез ДНК на матрице КНК. Для некоторых КНК налажена самостоятельная репликация без участия ДНК или РНК. Методом искусственной эволюции удалось вывести молекулы КНК с полезными свойствами (аптамеры), что ранее удавалось сделать только с ДНК и РНК. Исследование показало, что ДНК и РНК — не единственные полимеры, способные служить «веществом наследственности» и эволюционировать под действием мутаций и отбора. Открытие может иметь большое значение для биотехнологии, а также для общего понимания жизни и ее происхождения.

Всё живое на Земле использует для хранения и копирования наследственной информации только два класса полимеров: РНК и ДНК. Чем обусловлен этот выбор? Возможна ли жизнь, использующая в качестве «вещества наследственности» какие-то другие полимеры? Окончательного ответа пока нет, но химики пытаются его найти, экспериментируя с синтетическими полимерами — искусственными аналогами РНК и ДНК. Некоторые специалисты по пребиотической химии предполагают, что земная жизнь могла начаться не с РНК, а с другого способного к репликации полимера, синтез которого в отсутствие биологических катализаторов (белков-ферментов и рибозимов) происходил легче и быстрее, чем абиотический синтез РНК. Одним из кандидатов на эту роль считается ТНК — аналог РНК, у которого пятиуглеродная рибоза заменена на четырехуглеродный сахар — треозу (см. Тайна происхождения жизни скоро будет разгадана?, «Элементы», 12.01.2009).

Изучение альтернативных «генетических полимеров» сдерживается тем, что синтезировать их трудно и дорого. Производство молекул ДНК и РНК с любой нужной экспериментатору последовательностью нуклеотидов сегодня поставлено на поток благодаря использованию мощнейших природных катализаторов — ферментов-полимераз, которые осуществляют размножение молекул ДНК и РНК (репликацию), синтез РНК на матрице ДНК (транскрипцию) или синтез ДНК на матрице РНК (обратную транскрипцию). Полимеразы весьма привередливы в выборе субстрата, то есть тех длинных молекул, которые используются в качестве матрицы для копирования, и мономеров-нуклеотидов, из которых собирается копия. Как правило, природные полимеразы наотрез отказываются размножать КНК («ксенонуклеиновые кислоты»: так называют разнообразные искусственные аналоги ДНК и РНК). Из-за отсутствия эффективных методов репликации КНК и переноса генетической информации с ДНК на КНК (и обратно) само предположение о том, что КНК могут играть роль вещества наследственности, до сих пор оставалось недоказанным.

Команда исследователей из Великобритании, Бельгии, США и Дании сообщила в последнем выпуске журнала Science, что им удалось изготовить ферменты-полимеразы, способные переносить наследственную информацию с ДНК на шесть разных КНК (рис. 1), а также осуществлять процесс, аналогичный обратной транскрипции, то есть синтезировать комплементарные цепочки ДНК на матрице КНК.

Авторы взяли за основу белок TgoT — ДНК-полимеразу термофильной архебактерии Thermococcus gorgonarius, которая была обнаружена российскими микробиологами в гидротермальных источниках у побережья Новой Зеландии (Miroshnichenko et al., 1998. Thermococcus gorgonarius sp. nov. and Thermococcus pacificus sp. nov.: heterotrophic extremely thermophilic archaea from New Zealand submarine hot vents.). Структура этого фермента хорошо изучена (Hopfner et al., 1999. Crystal structure of a thermostable type B DNA polymerase from Thermococcus gorgonarius), что облегчает создание на его основе новых полимераз с заданными свойствами: в общих чертах понятно, в какие места молекулы нужно вносить случайные мутации, чтобы изменить избирательность фермента.

Искусственный отбор ферментов, способных синтезировать КНК на матрице ДНК, проводился при помощи хитрой методики, которую авторы назвали «compartmentalized self-tagging» («компартментализованное само-мечение») (рис. 2). Бактерий E. coli, в которых были вставлены плазмиды с разными мутантными версиями гена полимеразы TgoT, помещали в водно-жировую эмульсию, так что каждый вариант полимеразы оказывался в отдельной капельке воды — в той же самой, где находился и его ген («компартментализация»). В воду добавляли «ксенонуклеотиды», а также затравки-праймеры — короткие последовательности нуклеотидов, комплементарные участку той же плазмиды, в которой располагался ген полимеразы. Праймеры использовались не простые, а биотинилированные: к олигонуклеотидам прикреплялись молекулы биотина (см. Biotin).

Праймер присоединяется к комплементарному участку ДНК, а полимераза пытается его достроить, используя ксенонуклеотиды в качестве мономеров для синтеза КНК. Если ей это удается, праймер оказывается прикреплен к плазмидной ДНК более прочно. Это и есть «само-мечение», позволяющее отобрать плазмиды с удачными вариантами гена полимеразы при помощи шариков, покрытых стрептавидином (см. Streptavidin). Биотин, приделанный к праймеру, накрепко присоединяется к стрептавидину. В результате после промывки на шариках остаются только те плазмиды, чей ген полимеразы сумел обеспечить синтез КНК и, как следствие, более прочное соединение праймера с плазмидой. В отобранные варианты гена можно затем внести новые мутации и повторить процедуру отбора.

Рис. 2. Стратегия искусственного отбора полимераз, способных синтезировать КНК на матрице ДНК («компартментализованное само-мечение»). Большие круги с красными и синими фрагментами — плазмиды с разными вариантами гена полимеразы. Маленькие красные и синие шарики — полимеразы. Крошечные незакрашенные кружки с загогулинами — биотинилированные праймеры. Большие коричневые круги — шарики, покрытые стрептавидином, к которым присоединяется биотин, прикрепленный к праймеру. Промывка позволяет удалить те плазмиды, на которых синтез КНК не состоялся, и поэтому связь между плазмидой и праймером осталась непрочной. Остальные пояснения см. в тексте. Изображение из дополнительных материалов к обсуждаемой статье Pinheiro et al. в Science

Другие, столь же изощренные методики использовались для получения полимераз, способных переписывать наследственную информацию в обратном направлении: с КНК на ДНК. В итоге удалось получить аналоги прямых и обратных транскриптаз для всех шести КНК, а для одной из них (флюоро-арабино-нуклеиновой кислоты, FANA) вывели даже фермент, способный размножать (реплицировать) молекулы КНК напрямую, без участия ДНК. Правда, репликация FANA по своей эффективности пока сильно уступает стандартным методам размножения ДНК при помощи полимеразной цепной реакции.

Точность работы искусственных полимераз ниже, чем у их естественных аналогов, синтезирующих обычные ДНК и РНК, но всё же достаточно высока, чтобы с КНК можно было работать — например, ставить опыты по искусственной эволюции. Частота ошибок в полном цикле репликации (ДНК → КНК → ДНК) составляет от 4,3·10^–3 (для CeNA) до 5,3·10^–2 (для LNA). Для сравнения, в живых клетках частота ошибок при репликации ДНК обычно около 10^–8–10^–7, при обратной транскрипции 10^–5–10^–4, у некоторых РНК-содержащих вирусов точность копирования генетического материала может быть еще ниже.

Главная заслуга авторов в том, что выведенные ими полимеразы позволяют работать с разнообразными КНК примерно так же, как биологи давно уже работают с ДНК и РНК. Неудивительно, что авторы сразу попытались при помощи искусственной эволюции вывести молекулы КНК с какими-нибудь полезными свойствами. Попытка увенчалась успехом: на основе HNA со случайной последовательностью нуклеотидов при помощи мутаций и отбора были выведены молекулы, способные, подобно антителам и другим белкам-рецепторам, избирательно связываться с определенными веществами: лизоцимом из белка куриных яиц и фрагментом РНК вируса ВИЧ (см. TAR). Участки РНК, работающие наподобие рецепторов (их называют «аптамерами»), встречаются у живых организмов (см. Сложные РНК-переключатели — новый механизм регуляции генов, «Элементы», 18.10.2006) и легко выводятся искусственно. Успешное создание аптамеров на основе КНК показывает, что эти полимеры способны не только к хранению и копированию генетической информации, но и к дарвиновской эволюции.

Работа может оказаться важной в двух отношениях: практическом и теоретическом. С точки зрения практики, она открывает целое новое поле для биотехнологических разработок — от медицинских препаратов до альтернативных форм жизни. Не исключено, что на основе КНК можно будет создать эффективные средства регуляции активности генов. Молекулы КНК, комплементарные фрагментам тех или иных генов, будут связываться с соответствующими матричными РНК и тем самым подавлять активность гена. Чужеродные РНК или ДНК, попадающие в клетку извне, как правило, быстро уничтожаются ферментами-нуклеазами. Но КНК неуязвимы для нуклеаз, имеющихся у живых клеток (по той же причине, по которой природные полимеразы отказываются их размножать: они просто не распознают их как свой субстрат). Поэтому препараты для подавления активности генов, основанные на антисмысловых КНК, могут оказаться эффективнее аналогичных препаратов, основанных на РНК. К тому же разные КНК обладают разными химическими характеристиками, что расширяет спектр областей их возможного применения. Например, авторы показали, что в кислой среде некоторые КНК гораздо устойчивее, чем ДНК.

С теоретической точки зрения, исследование может оказаться важным для общего понимания земной жизни и ее происхождения. Теперь уже можно считать доказанным, что не только ДНК и РНК, но и другие полимеры могут хранить генетическую информацию и эволюционировать. Это делает более правдоподобными гипотезы о том, что жизнь могла начаться не с РНК, а с какого-то иного полимера, который легче синтезировался абиогенным путем и впоследствии был вытеснен РНК. При поиске жизни на других планетах эти результаты тоже следует учитывать. В конце концов может оказаться, что земная жизнь основана на ДНК и РНК не из-за каких-то уникальных свойств этих молекул, а просто в силу исторической случайности.

Данное исследование — один из первых шагов в неизведанную область, в целый новый мир альтернативных генетических полимеров. Можно смело ожидать скорого открытия первых ксенозимов — молекул КНК с каталитическими свойствами. Не исключено, что и работы по созданию искусственной жизни пойдут бодрее на основе открывшегося разнообразия потенциальных «веществ наследственности».

Источники:
1) Vitor B. Pinheiro, Alexander I. Taylor, Christopher Cozens, Mikhail Abramov, Marleen Renders, Su Zhang, John C. Chaput, Jesper Wengel, Sew-Yeu Peak-Chew, Stephen H. McLaughlin, Piet Herdewijn, Philipp Holliger. Synthetic Genetic Polymers Capable of Heredity and Evolution // Science. 2012. V. 336. P. 341–344.
2) Gerald F. Joyce. Toward an Alternative Biology // Science. 2012. V. 336. P. 307–308.

См. также:
Тайна происхождения жизни скоро будет разгадана?, «Элементы», 12.01.2009.

Александр Марков