Пероральный инсулин, или Как обмануть желудок

Лев Валуев, Иван Валуев,
Институт нефтехимического синтеза имени А. В. Топчиева РАН (Москва, Россия)
«Природа» №7, 2021

В настоящее время в мире насчитывается более 420 млн больных сахарным диабетом, и многим из них для поддержания оптимального уровня глюкозы в крови необходим инсулин. Самый распространенный способ его введения — инъекции, которые пациент должен делать несколько раз в день. Это не только травматично и неудобно, но и несет определенные риски. Поэтому во многих лабораториях мира ведется поиск альтернативных, неинвазивных, способов доставки инсулина. Очевидно, что самый привлекательный и физиологичный из них — пероральный (в виде таблеток или растворов). В статье рассматриваются его преимущества и ограничения, а также обсуждается новая стратегия лечения сахарного диабета, основанная на использовании разбавленных растворов инсулина и подкрепленная результатами экспериментов, в которых удалось добиться гипогликемического эффекта.

На всякого мудреца довольно простоты.
А. Н. Островский

Об авторах

Лев Иванович Валуев — доктор химических наук, профессор, главный научный сотрудник Института нефтехимического синтеза имени А. В. Топчиева (ИНХС) РАН. Лауреат Государственной премии РФ в области науки и техники (2002), Область научных интересов — химическая модификация синтетических полимеров биологически активными веществами и создание полимеров медицинского назначения. e-mail: valuev@ips.ac.ru.

Иван Львович Валуев — доктор химических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории химии полиэлектролитов и медико-биологических полимеров ИНХС РАН. Научные интересы связаны с изучением биологически активных полимерных гидрогелей, полимерных производных инсулина, глюкозочувствительных полимеров и направленного транспорта лекарств в организме.

В 1923 г. Нобелевская премия по физиологии или медицине была присуждена «за открытие инсулина»¹ сотрудникам Торонтского университета (University of Toronto; Канада) Ф. Г. Бантингу (F. G. Banting; 1891–1941) и Д. Д. Маклеоду (J. J. Macleod; 1876–1935), которые в 1921 г. выделили из экстракта поджелудочной железы инсулин [1] и вскоре применили его для лечения сахарного диабета [2].

11 января 2022 г. исполнится сто лет с того дня, когда канадский врач и физиолог Бантинг со своим ассистентом Ч. Г. Бестом (Ch. H. Best; 1899–1978) впервые сделали инъекцию инсулина 14-летнему подростку, который страдал сахарным диабетом. И хотя результаты этой процедуры были не самыми удачными (в основном из-за низкой степени очистки препарата), именно они выявили роль инсулина в развитии сахарного диабета и заставили ученых разработать новые методы получения высокоочищенного гормона. Это позволило сохранить жизнь сотням миллионов людям, страдающим заболеванием, которое Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) назвала неинфекционной эпидемией XX и XXI вв.

По последним данным ВОЗ, в настоящее время в мире насчитывается более 420 млн больных сахарным диабетом, а к 2030 г. их количество, по прогнозам экспертов, возрастет до 578 млн [3].

Фредерик Бантинг (справа) со своим ассистентом Чарлзом Бестом. В 1921 г. они впервые получили и практически применили инсулин. Торонто, около 1924 г.

Для поддержания оптимального уровня глюкозы в крови многим пациентам с сахарным диабетом типа 2 и всем — типа 1 жизненно необходим инсулин. Самый распространенный способ его введения — инъекции, которые пациент должен делать несколько раз в день. Это не только травматично и неудобно, но и несет определенные риски. Ученые всего мира заняты поиском и разработкой альтернативных способов доставки препаратов пептидной природы, в том числе инсулина, для лечения эндокринных нарушений. Очевидно, что пероральная форма лекарства — особенно привлекательна, но на ее пути возникают препятствия, связанные с физиологией желудочно-кишечного тракта (ЖКТ). Как можно преодолеть этот барьер и попытаться обмануть желудок?

Инсулин

Инсулин (от лат. insula — остров) — гормон пептидной природы, который вырабатывают ″-клетки островков Лангерганса в поджелудочной железе, чувствительные к уровню глюкозы в крови [4].

Микрофотография поперечного среза поджелудочной железы человека. В центре виден бледно окрашенный островок Лангерганса, который на 75–80% состоит из β-клеток, синтезирующих инсулин (сине-зеленые гранулы). Увел. ×200; окраска гематоксилин-эозином. Фото Ф. А. Рейнольдсa (F. A. Reynolds; BCC Bioscience Image Library).

В отличие от большинства других гормонов, инсулин — довольно крупный белок (C₂₅₇H₃₈₃N₆₅O₇₇S₆; молекулярная масса — 5808 Да²). Его молекула образована двумя полипептидными цепями, которые состоят из 51 аминокислоты (A-цепь — из 21, B-цепь — из 30) [5]. Полипептидные цепи соединены двумя дисульфидными мостиками через остатки цистеина; третья дисульфидная связь расположена в A-цепи. Молекулы инсулина имеют тенденцию образовывать димеры в растворе из-за образования водородных связей между C-концами B-цепей. Кроме того, в секреторных гранулах димеры, соединяясь с ионами цинка, образуют кристаллические гексамерные агрегаты. Они отличаются долговременной стабильностью, но при этом легко распадаются на мономеры — активные формы инсулина.

Инсулин оказывает многогранное влияние на обмен веществ практически во всех тканях [6]. Но основное его действие — регулирование углеводного обмена, в частности утилизация глюкозы в организме. Только он помогает клеткам для удовлетворения их энергетических нужд поглощать из крови глюкозу. Дефицит инсулина и становится причиной сахарного диабета, поэтому сейчас лечение этого заболевания в основном сводится к периодическим (несколько раз в сутки) инъекциям этого гормона.

Микрофотография β-клетки. Темные пятна, окруженные белой областью, — инсулиновые гранулы, цветные границы — метки для их идентификации. Фото Т. МакКланахана (T. McClanahan; NASA).

К настоящему времени разработаны десятки лекарственных форм с различной активностью и весьма широким диапазоном времени функционирования в организме. И, хотя такой способ лечения позволяет сохранить жизнь большинству больных диабетом, введение инсулина непосредственно в кровоток, кроме неудобства, имеет принципиальный недостаток.

В физиологических условиях выделяемый поджелудочной железой инсулин попадает в кровоток через печень, которая и осуществляет контроль количества выделяемого в кровь гормона. При инъекционном введении печень теряет такой контроль и концентрация инсулина, достигаемая в различных органах, может существенно отличаться от той, которая необходима в данный момент времени и в данном месте. Принимая во внимание, что биологическое действие инсулина многогранно (в частности, он служит универсальным анаболическим гормоном), этот способ введения препарата может приводить к ряду таких серьезных осложнений, как сердечно-сосудистые заболевания, расстройство функций головного мозга и т. п. [7]. В связи с этим оптимальным с физиологической точки зрения представляется пероральное введение инсулина, при котором он, как и продукты пищеварения, первоначально попадал бы в печень, моделируя в дальнейшем естественный путь поступления гормона в кровоток. Однако на этом пути природа поставила весьма серьезный барьер.

Ферментативный барьер

В пищеварительной системе под действием протеолитических ферментов желудка (в основном пепсина) и тонкого кишечника (трипсина и ±-химотрипсина) происходит гидролитическое расщепление белков и полипептидов до аминокислот, которые затем быстро всасываются через слизистую оболочку кишечника. Вслед за этим продукты пищеварения сразу проникают в печень — главную химическую лабораторию организма, где они и подвергаются сложной обработке. Именно поэтому все жизненно важные вещества полипептидной природы, в частности инсулин, синтезируются внутри организма, а не попадают в него с пищей. Для устранения дефицита инсулина в организм вводят полипептид инъекционно (например, внутримышечно или внутривенно) в виде раствора, минуя пищеварительную систему. Вместе с тем до сих пор не прекращаются попытки ученых преодолеть воздвигнутые природой барьеры на пути таких лекарств в кровоток через ЖКТ, поскольку преимущества перорального способа введения инсулина, да и других полипептидных лекарственных препаратов, велики и очевидны.

Сейчас известны многие десятки различных подходов к решению этой проблемы [8]. Так, по данным Национального центра биотехнологической информации США (National Center for Biotechnology Information), инсулин считается самым изученным гормоном (более 300 тыс. цитирований, и только за последний год опубликовано свыше 400 работ по изучению возможности создания пероральных форм этого гормона). Не останавливаясь детально на сути этих подходов, которые включают модификацию молекулы инсулина, применение разного рода защитных покрытий гормона, совместное использование инсулина и ингибиторов протеолитических ферментов, а также соединений, ускоряющих всасывание инсулина через слизистую оболочку тонкого кишечника, отметим лишь, что до сих пор не существует реально применяемых в клинических условиях препаратов инсулина для перорального применения³.

Для достижения положительного эффекта при пероральном введении инсулина необходимо выполнение двух условий: предотвращение гидролитического расщепления гормона в желудке и ингибирование (или замедление) ферментативного протеолиза в тонком кишечнике. Главное — доставить нативный инсулин на слизистую оболочку тонкого кишечника. А дальше, как известно из литературы, он уже будет диффундировать в кровоток через эту оболочку. Так, в работе [9] приведены данные о том, что, если введение 3 ед. инсулина непосредственно в желудок кролика не сопровождается изменением концентрации глюкозы в крови, то при введении такого же количества инсулина в тощую кишку, минуя желудок, уровень глюкозы в крови снижается на 50%. Примерно такое же снижение концентрации глюкозы в крови наблюдается и при внутримышечной инъекции 3 ед. инсулина. Снижение концентрации глюкозы в крови наблюдали также на здоровых и диабетных крысах при замене питьевой воды на концентрированный (100 ед./мл) раствор инсулина [10]. Однако при этом было обнаружено такое парадоксальное явление, как потеря веса животными. При их вскрытии в пищеварительном тракте была обнаружена непереваренная пища, т. е. инсулин в чрезвычайно больших дозах вызывал серьезное нарушение процесса пищеварения.

Схематические изображения инсулина. Слева — мономер (flickr.com; public domain), где две полипептидные цепи (зеленый цвет — A-цепь, красный — B-цепь) соединены дисульфидными мостиками (S–S); справа — гексамер [4], в котором шесть мономеров (показаны разными цветами) удерживают вместе остатки гистидина, связанные ионами цинка.

Разбавленный раствор

В 2000-х годах в нашем институте были начаты по инициативе академика Н. А. Платэ [11–14] и в дальнейшем продолжены его учениками работы по изучению нестандартного подхода к решению проблемы защиты инсулина в пищеварительной системе, основанного на двух известных природных явлениях. Оказалось, что если природа и воздвигает различного рода барьеры, то обычно она же и указывает пути их преодоления. Надо только поискать.

Хорошо известно, что поглощенная вода быстро, практически не смешиваясь с твердой пищей, проходит по малой кривизне через желудок в тонкий кишечник, где и всасывается в кровь со скоростью, минимальное значение которой составляет 200–400 мл/ч. Таким образом, уже через 10–15 мин до 90% воды оказывается в тонком кишечнике [15].

Мы предположили, что при достаточно низкой концентрации инсулина в растворе удастся так «обмануть» желудок, что железы его слизистой оболочки не успеют прореагировать на появление полипептида, и возникнет реальная возможность предотвратить гидролиз гормона в желудке. Использование разбавленных растворов должно также существенно замедлить скорость ферментативного гидролиза гормона в тонком кишечнике, которая, как известно, пропорциональна концентрации реагирующих веществ.

Эти предположения были проверены в экспериментах на животных, проведенных в ведущих медицинских учреждениях страны — Институте медико-биологических проблем РАН, Эндокринологическом научном центре РАМН, Российской медицинской академии последипломного образования МЗ РФ.

Для изучения эффективности действия инсулина кроликам перорально вводили раствор этого гормона в различной концентрации (табл. 1). Выяснилось, что введение 1 мг инсулина, растворенного в 1 мл воды, не влияло на уровень глюкозы в крови животных, а та же доза гормона, растворенного в 10–15 мл, снижала концентрацию глюкозы на 30–40%. Это значит, что, как и предполагалось, при пероральном введении разбавленные растворы инсулина довольно быстро (как и вода) проникают в тонкий кишечник, не разрушаясь в желудке, и значительная его часть достигает стенок кишечника, оказываясь практически вне зоны действия панкреатических ферментов. Таким образом, природа сама помогает преодолеть воздвигнутые ей преграды.

Поскольку в этом случае движущей силой процесса абсорбции является градиент концентрации инсулина в просвете кишечника, то эффективность всасывания гормона определяется видом животного. Так, при переходе от кроликов (диаметр кишечника 1.7–2 см) к грызунам (диаметр кишечника около 2–4 мм) эффективность всасывания инсулина увеличивается более чем в два раза [10]. Поглощенный инсулин проходит более короткий путь, чтобы достигнуть слизистой оболочки кишечника, и вероятность его гидролиза под действием протеолитических ферментов уменьшается.

Как и предполагалось, перорально введенный инсулин в первую очередь поступает в печень, где участвует в регуляции различных биохимических процессов, и лишь затем он попадает на периферию через большой круг кровообращения (табл. 2).

Поступающий в кровь инсулин сохраняет гипогликемическую активность и способен выполнять свою физиологическую функцию при лечении сахарного диабета. Экспериментальный сахарный диабет на кроликах моделировали введением животным массой 2.5–3.1 кг аллоксана в дозе 150 мг на 1 кг массы. В последующие 10 суток уровень глюкозы в крови повышался с исходных 90–110 мг/100 мл до 400–450 мг/100 мл, что указывало на развитие диабета. В долговременном эксперименте животным ежедневно с 10-х по 15-е и с 20-х по 26-е сутки перорально вводили 14 ед. инсулина в 7 мл воды (табл. 3). Для удобства применения раствор готовили непосредственно перед введением животным путем растворения в воде твердой композиции, содержащей инсулин, бикарбонат натрия и лимонную кислоту. В воде бикарбонат натрия реагировал с кислотой с выделением углекислого газа, который и обеспечивал быстрое перемешивание раствора.

Было обнаружено, что ежесуточное введение раствора инсулина в течение первых пяти суток после развития экспериментального диабета приводило к снижению уровня глюкозы в крови, который частично восстанавливался на 20-й день после прекращения. Ежедневное введение раствора инсулина в течение последующих пяти суток сопровождалось повторным снижением уровня глюкозы, который практически не изменялся после прекращения введения раствора до окончания эксперимента (см. табл. 3). Концентрация глюкозы в крови кроликов контрольной группы (четыре животных) в течение всего эксперимента оставалась на уровне 400–500 мг/100 мл.

Практически аналогичный результат был получен на крысах, экспериментальный диабет у которых моделировали введением стрептозотоцина. В долговременном эксперименте крысам ежеднев-

но с 16-х до 20-х суток вводили 5 мл раствора с 10 ед. инсулина. При этом наблюдали снижение уровня глюкозы с 480–500 до 100–129 мг/100 мл.

Отметим, что возможность проникновения в кровь при пероральном введении разбавленных растворов есть и у других полипептидов, например глюкагона — полипептида с молекулярной массой примерно 3500 Да, ответственного за повышение уровня глюкозы в крови. При пероральном введении 0.5 мг глюкагона в 1 мл воды каких-либо изменений концентрации глюкозы не наблюдали. В то же время введение 0.5 мг полипептида, растворенного в 10 мл воды, сопровождалось увеличением концентрации глюкозы в крови на 60%. И в этом случае определяющим фактором являлась концентрация полипептида, а не его количество. Так, введение 0.5 мг глюкагона в 10 мл приводит к более ярко выраженному эффекту, чем 1 мг в том же количестве растворителя.

Повышение степени проникновения в кровь при снижении концентрации раствора было характерно и для более высокомолекулярного белка, например гормона роста (молекулярная масса примерно 24 000 Да). Пероральное введение кроликам 1 мг гормона в 6 мл раствора приводило к росту его концентрации в крови почти на порядок.

Таким образом, совокупность всех полученных результатов позволяет сделать вывод, что при пероральном введении разбавленных растворов инсулина не происходит разрушения гормона пищеварительными ферментами, а он всасывается в кровь, практически реализуя затем естественный путь своего поступления в кровь через печень. Принимая во внимание положительные результаты испытания растворов инсулина на животных с экспериментальным диабетом, можно высказать осторожное предположение, что эти растворы могут быть альтернативой инъекциям гормона при лечении сахарного диабета. Кроме прикладного, полученные результаты имеют и фундаментальное значение, доказывая существование еще одного пути проникновения полипептидов в системное кровообращение.

Авторы выражают искреннюю благодарность профессорам Л. К. Старосельцевой и А. С. Аметову, академику А. И. Григорьеву за помощь в организации проведения работы с животными.

Литература:

1. Banting F.G., Best C.H. Pancreatic extracts. 1922. J. Lab. Clin. Med. 1990; 115(2): 254–272.

2. Banting F.G., Best C.H., Collip J.B. et al. Pancreatic extracts in the treatment of diabetes mellitus. Can. Med. Assoc. J. 1922; 12(3): 141–146.

3. Профилактика и диагностика диабета и борьба с ним. Обновленная информация о семьдесят четвертой сессии Всемирной ассамблеи здравоохранения — 27 мая 2021 г.

4. Koeslag J.H., Saunders P.T., Terblanche E. A reappraisal of the blood glucose homeostat which comprehensively explains the type 2 diabetes mellitus-syndrome X complex. J. Physiol. 2003; 549(2): 333–346. DOI:10.1113/jphysiol.2002.037895.

5. Chang X., Jorgensen A.M., Bardrum P., Led J.J. Solution structures of the R6 human insulin hexamer, Biochemistry. 1997; 36(31): 9409–9422. DOI:10.1021/bi9631069.

6. Теппермен Дж., Теппермен Х. Физиология обмена веществ и эндокринной системы. Вводный курс. Кандрор В.И. (пер. с англ.); Ажипа Я.И. (ред.). М., 1989.

7. Saffran M. Targeting of Drugs 3: The Challenge of Peptides and Proteins. Gregoriadis G. (ed.). N.Y., 1992; 89–95.

8. Shah R.B., Patel M., Maahs D.M., Shah V.N. Insulin delivery methods: Past, present and future. Int J Pharm Investig. 2016 Jan-Mar; 6(1): 1–9. DOI:10.4103/2230-973X.176456.

9. Lee V.H. Enzymatic barriers to peptide and protein absorption. Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 1988; 5(2): 69–97.

10. Saffran M., Pansky B., Colin Budd G., Williams F.E. Insulin and the gastrointestinal tract. J. of Controlled Release. 1997; 46(1): 89–98. DOI:10.1016/S0168-3659(96)01578-7.

11. Григорьев А.И., Платэ Н.А., Валуев Л.И. и др. К вопросу о возможности использования пероральной формы инсулина. Клиническая медицина. 2005; 83(1): 32–35.

12. Валуев Л.И., Платэ Н.А., Старосельцева Л.К. и др. Раствор инсулина для перорального введения. Химико-фармацевтический журнал. 2006; 40(4): 47–50.

13. Валуев Л.И., Платэ Н.А., Старосельцева Л.К. и др. О возможности перорального введения растворов белков. Прикладная биохимия и микробиология. 2007; 43(1): 114–117.

14. Валуев Л.И., Валуев И.Л., Ванчугова Л.В. и др. Пероральный препарат инсулина для регулирования уровня глюкозы в крови. Биомедицинская химия. 2009; 55(2): 195–200.

15. Jensen D. The Principles of Physiology, Appleton-Century-Crofts, N.Y., 1980.

¹ The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1923 (www.nobel- prize.org/prizes/medicine/1923/summary/).

² Рассчитано PubChem 2.1 (версия 2021.05.07): pubchem.ncbi.nlm. nih.gov/compound/16129672

³ Несколько фармацевтических компаний занимаются разработкой носителей для защиты инсулина от деградации в ЖКТ и облегчения его доставки в кровоток с достаточной биодоступностью. Некоторые пероральные препараты инсулина уже прошли или проходят клинические испытания и показали многообещающие результат. К примеру, 8 июня 2021 г. на сайте фармацевтической компании Oramed Pharmaceuticals Inc. (США) было опубликовано сообщение о регистрации и рандомизации более 50% из 675 запланированных пациентов, участвующих в первом из двух этапов третьей фазы клинических испытаний препарата ORMD-0801 для лечения сахарного диабета типа 2. Препарат ORMD-0801 создан на основе технологии PODTM (пероральной доставки протеина): активный белок заключен в капсулу, которая выдерживает кислую среду пищеварительного тракта, защищает от действия его ферментов (оболочка содержит ингибиторы протеаз), а также облегчает прохождение белка через кишечный барьер (содержит добавку, усиливающую абсорбцию). Испытания ORMD-0801 одобрены Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (Food and Drug Administration), проводятся в 75 клиниках мира и должны завершиться к четвертому кварталу 2021 г. Подробнее о разработке см.: Eldor R., Arbit E, Corcos A., Kidron M. Glucose-reducing effect of the ORMD-0801 oral insulin preparation in patients with uncontrolled type 1 diabetes: a pilot study. PLoS One. 2013; 8(4): e59524. DOI:10.1371/journal.pone.0059524; Arbit E., Kidron M. Oral insulin delivery in a physiologic context. J. Diabetes Sci. Technol. 2017; 11(4): 825–832. DOI:10.1177/1932296817691303. — Примеч. ред.