Метаболом сибирской лягушки в аноксии

Даниил Берман, доктор биологических наук, Институт биологических проблем Севера ДВО РАН (Магадан, Россия),
Сергей Шеховцов, кандидат биологических наук, Институт цитологии и генетики СО РАН (Новосибирск, Россия)
«Природа» №11, 2020

Гипоксия возникает при недостатке кислорода в атмосферном воздухе или при нарушении тканевого дыхания. Нередко она становится причиной многих несчастий, и отнюдь неслучайно Нобелевская премия 2019 г. по физиологии и медицине присуждена «за открытие механизмов, посредством которых клетки воспринимают доступность кислорода и адаптируются к ней»¹. В заявлении Нобелевского комитета отмечается, что исследования проливают свет на один из самых необходимых для жизни процессов — приспособление клетки к постоянно изменяющемуся уровню кислорода.

Общий адаптивный принцип противостояния организма гипоксии сводится к подавлению интенсивности метаболизма и переходу на анаэробный обмен, при этом пути получения энергии у животных, относящихся к разным группам, отличаются. Арсенал используемых в экспериментах моделей довольно ограничен. В сферу академических интересов при поиске разных биохимических схем адаптаций к гипоксии попали моллюски, рыбы и некоторые виды черепах. Все они постоянно или периодически сталкиваются с дефицитом кислорода в среде обитания. Среди лягушек — традиционных лабораторных моделей, на которых изучены многие физиологические процессы, — до последнего времени не было известно ни одного вида, переносящего значительную гипоксию, тем более — аноксию (полное отсутствие кислорода в среде).

В 2017 г. мы обнаружили вероятного претендента на роль такого модельного объекта². Им оказалась сибирская лягушка (Rana amurensis) — один из широко распространенных и массовых видов амфибий на значительной части Северной Азии, а также в Китае и северной Монголии. В Якутии, самом холодном зимой регионе России, сибирская лягушка обитает вплоть до 71° с. ш., и в долине средней Лены почти столь же многочисленна, как и на юге Дальнего Востока; осенью здесь можно встретить до 500 лягушек на 1 км пути. Вероятно, из-за столь северного распространения этот вид долгое время считали одним из самых резистентных среди амфибий. Однако это оказалось не так: R. amurensis не переносит длительного охлаждения ниже −2,5°C, и, значит, не может зимовать в северных регионах (в том числе, на вечной мерзлоте) на суше, а лишь в непромерзающих водоемах. Однако для многих территорий Северной Азии характерна «заморность» озер — катастрофическое падение концентрации кислорода зимой. Именно «заморами», как считается, может быть ограничено распространение зимующих в воде видов³.

Существовало мнение, что лягушки переносят гипоксию лучше, чем млекопитающие, но много хуже, чем некоторые пресноводные черепахи и рыбы. Лишь немногие европейские и американские виды рода Rana способны ограниченное время существовать при 2,5–2,6 мг/л О₂ и совсем кратковременно — при аноксии. Исследования динамики концентрации растворенного кислорода в зимовочных водоемах сибирской лягушки в различных частях ареала показали, что его содержание падает до 0–2,1 мг/л, не вызывая массовой гибели лягушек, в отличие от рыбы при «заморах»⁴.

В лабораторных экспериментах R. amurensis оказалась способна существовать до 97 дней в герметически закрытых небольших емкостях с водой в условиях почти полной аноксии (менее 0,2 мг/л О₂) при температуре 2–3°C, сохраняя способность реагировать на внешние раздражители (рис. 1). Таким образом, показано, что сибирская лягушка зимой, сохраняя активность, обходится без кислорода (не дышит) и, вероятно, переходит на анаэробный обмен⁵.

Рис. 1. Изменения уровней растворенного кислорода в воде в экспериментах по выяснению способности Rana amurensis переносить гипоксию (а) и продолжительность выживания в условиях экстремальной гипоксии (б). Каждая линия — один герметичный контейнер с лягушкой; каждый флажок указывает на смерть одной особи. Изображение из статьи: Berman D. I., Bulakhova N. A., Meshcheryakova E. N. The Siberian wood frog survives for months underwater without oxygen // Sci. Rep. 2019; 9: 13594

Уникальная способность создала возможность колонизовать сибирской лягушкой огромные пространства, большая часть которых лежит в зоне действия Сибирского антициклона с длительными холодными и малоснежными зимами. Кроме того, здесь большинство непроточных мелких непромерзающих водоемов, в том числе на вечной мерзлоте, зимой почти полностью лишены кислорода. Это термокарстовые озера, формирование которых связано с протаиванием грунтовых льдов, возникающем при повреждении поверхностного изолирующего горизонта — растительного покрова (чаще всего с участием мхов), торфяного слоя почв и т.д. Образно говоря, чтобы колонизовать Сибирь, Rana amurensis надо было преодолеть жуткие морозы или приспособиться к почти полной аноксии!

Выявленная адаптация сибирской лягушки к длительной экстремальной гипоксии в активном состоянии — первый известный случай такого рода в классе амфибий. Удостоверившись, что R. amurensis действительно способна выживать в условиях экстремальной гипоксии в течение нескольких месяцев, мы задались следующим естественным вопросом: каким образом она этого достигает? Для начала важно было выявить химические различия между тканями в состоянии нормоксии и гипоксии. Был использован метод ядерного магнитного резонанса, который до совершенства доведен в Международном томографическом центре СО РАН в лаборатории протеомики и метаболомики под руководством профессора Ю. П. Центаловича. Метод позволяет одновременно определять концентрации более 50 метаболитов в одной пробе. При отсутствии кислорода клетки испытывают энергетический стресс. Отчасти его можно преодолеть, подавляя затраты, отчасти — усилив катаболизм углеводов путем гликолиза или параллельных ему путей. Эти ответы у большинства позвоночных не могут компенсировать испытываемый стресс. Гипоксия в конце концов приводит к активации апоптоза и некрозу, что рано или поздно заканчивается летальным исходом. Однако сибирская лягушка справляется с этим состоянием. По изменениям концентраций метаболитов можно реконструировать биохимические пути и постараться понять, чем же ответ сибирской лягушки так отличается от реакции других животных.

Рис. 2. Концентрации малых энергетических молекул: ФКр — фосфокреатин, Кр — креатин; зеленые столбики — нормоксия, красные — гипоксия. Изображение из статьи: Shekhovtsov S. V., Bulakhova N. A., Tsentalovich Yu. P., Zelentsova E. A., Yanshole L. V., Meshcheryakova E. N., Berman D. I. Metabolic response of the Siberian wood frog Rana amurensis to extreme hypoxia // Sci. Rep. 2020; 10: 14604

Оказалось, что и лягушки не нашли легкого способа приспособиться к гипоксии⁶. Они испытывают сильный энергетический стресс: концентрации АТФ и креатинфосфата значительно падают, а АМФ и креатина, соответственно, растут (рис. 2, а, б). Кроме того, отключение окислительного фосфорилирования приводит к накоплению NADH, который не может в таких условиях быть использован для получения энергии в митохондриях (рис. 2, в). Соответственно, истощаются запасы NAD+, и многие реакции становятся недоступными. Для сравнения на рисунках даны результаты, полученные для сердца неустойчивых к гипоксии мышей и устойчивых североамериканских красноухих черепах⁷. Можно видеть, что концентрации АТФ у черепах практически не снижаются при отсутствии кислорода, что интерпретируется как уникальное приспособление этого вида к гипоксии. У сибирской лягушки же и в норме концентрации АТФ были крайне малы по сравнению с черепахами и мышами, а при отсутствии кислорода снижались еще сильнее. Следовательно, сибирская лягушка действительно находится в сильном энергетическом стрессе. Тем не менее, очевидно, он не вызывает настолько тяжелых последствий, как у большинства других позвоночных. Продукты распада нуклеотидов, которые в большом количестве появляются у мышей, у сибирской лягушки найдены не были, что свидетельствует об обратимости наблюдаемых процессов.

Как не трудно предположить, при остановке окислительного фосфорилирования будет активироваться гликолиз или параллельные ему процессы для того, чтобы хотя бы отчасти компенсировать недостаток энергии. Поэтому можно было ожидать накопление конечных продуктов гликолиза. И в самом деле, количество молочной кислоты (лактата) в обоих исследованных органах достоверно выросло (рис. 3, а). Второй наиболее часто встречающийся у позвоночных продукт гликолиза, аланин, также накапливался, причем в печени его оказалось гораздо больше, чем лактата. Таким образом, в ответ на гипоксию активируются разные метаболические пути в разной степени.

Рис. 3. Концентрации глюкозы, продуктов гликолиза и компонентов цикла Кребса: 1 — глюкоза, 2 — лактат, 3 — аланин, 4 — 2,3-БД, 5 — сукцинат, 6 — фумарат, 7 — цитрат; зеленые столбики — нормоксия, красные — гипоксия. Изображение из статьи: Shekhovtsov S. V., Bulakhova N. A., Tsentalovich Yu. P., Zelentsova E. A., Yanshole L. V., Meshcheryakova E. N., Berman D. I. Metabolic response of the Siberian wood frog Rana amurensis to extreme hypoxia // Sci. Rep. 2020; 10: 14604

Особенность сибирской лягушки в условиях гипоксии — появление в ее органах значительных количеств 2,3-бутандиола (вещества, сопровождающего метаболизм алкоголя, а также встречающегося при ишемии у млекопитающих). Тем не менее, о его происхождении и роли ничего неизвестно. Мы предполагаем, что 2,3-бутандиол служит побочным продуктом гликолиза; биохимические процессы, ведущие к его возникновению, еще предстоит выяснить.

Наряду с проблемой энергетического обеспечения организма, гипоксия приводит к стрессу реоксигенации: после возобновления подачи кислорода клетки производят активные его формы, служащие повреждающим факторам. В их возникновении большую роль играют митохондрии. Предполагается, что основной фактор здесь — накопление сукцината в значительных количествах при гипоксии и затем его быстрый перевод в фумарат при появлении кислорода, что сопровождается синтезом свободных радикалов. Считается, что устойчивые к гипоксии виды находят способ ограничить накопление сукцината. Это мы и наблюдали у сибирской лягушки: его количество у лягушек сходно с таковым у черепах и на порядок меньше, чем у мышей (рис. 3, б).

Подготовка организма к стрессу реоксигенации включает в себя также синтез и активацию защитных молекул. Одной из них служит глутатион, который может нейтрализовать пероксиды и свободные радикалы. Оказалось, что количество глутатиона в печени сибирской лягушки при гипоксии возрастает в три раза. В сердце его концентрации при нормоксии так же высоки, как и в гипоксической печени, а при отсутствии кислорода почти не меняется. Следует отметить, что у мышей концентрация глутатиона в сердце приблизительно в 15 раз ниже, чем у сибирской лягушки. Это свидетельствует об адаптации R. amurensis к гипоксии путем конститутивного усиления антиоксидантной защиты, т.е. независимо от того, находится особь в гипоксических условиях или нет.

Таким образом, теперь в распоряжении физиологов находится новая модель устойчивости к отсутствию кислорода в среде — сибирская лягушка. При помощи современных методов удалось прояснить ее метаболомный ответ на гипоксию. Но для того, чтобы понять механизмы устойчивости, потребуются более глубокие исследования, которые покажут динамику влияния гипоксии на экспрессию генов и белков, активности ключевых ферментов и концентрации метаболитов.

¹ Подробнее см.: Сафронова О. С. Нобелевская премия 2019 г. по физиологии или медицине — Уильям Кэлин, сэр Питер Рэтклифф, Грегг Семенза // Природа. 2019; 12: 56–61. DOI: 10.7868/S0032874X19120081.

² Подробнее см.: Берман Д. И., Булахова Н. А., Балан И. В. Самая сибирская лягушка // Природа. 2017; 8: 3–14.

³ Подробнее см.: Берман Д. И., Булахова Н. А. Граница на заморе, или что не пускает травяную лягушку в Азию // Природа. 2019; 7: 12–26. DOI: 10.7868/S0032874X19070020.

⁴ Берман Д. И., Булахова Н. А., Балан И. В. Самая сибирская лягушка // Природа. 2017; 8: 3–14.

⁵ Berman D. I., Bulakhova N. A., Meshcheryakova E. N. The Siberian wood frog survives for months underwater without oxygen // Sci. Rep. 2019; 9: 13594.

⁶ Shekhovtsov S. V., Bulakhova N. A., Tsentalovich Yu. P., Zelentsova E. A., Yanshole L. V., Meshcheryakova E. N., Berman D. I. Metabolic response of the Siberian wood frog Rana amurensis to extreme hypoxia // Sci. Rep. 2020; 10: 14604.

⁷ Bundgaard A., James A. M., Gruszczyk A. V. et al. Metabolic adaptations during extreme anoxia in the turtle heart and their implications for ischemia-reperfusion injury // Sci. Rep. 2019; 9: 2850.