Новое о нитрате: сигнальная роль в растениях

Станислав Измайлов, Андрей Никитин, Владимир Родионов
«Природа» №4, 2018

Об авторах

Станислав Федорович Измайлов — доктор биологических наук, профессор, заведующий лабораторией азотного обмена Института физиологии растений им. К. А. Тимирязева РАН. Область научных интересов — симбиотическая азотфиксация, азотный обмен растений. Лауреат научных премий Президиума РАН, всероссийских и международных научных обществ. Член Творческого союза художников России и Международной федерации художников.

Андрей Валентинович Никитин — научный сотрудник той же лаборатории. Научные интересы связаны с азотным обменом и его взаимодействием с углеродным метаболизмом, сигнальной ролью нитрата и аммония в растениях.

Владимир Александрович Родионов — кандидат сельскохозяйственных наук, научный сотрудник той же лаборатории. Занимается азотным обменом в растениях, сигнальной ролью нитрата и аммония в них, рациональным применением азотных удобрений в современных агробиотехнологиях.

Уже почти 200 лет ученые разных стран мира исследуют усвоение растениями азота. В различные периоды истории отчетливо прослеживается довольно весомый вклад отечественной науки. За последние 15–20 лет выделяются новые направления исследований, благодаря которым стало понятно, что нитрат (NO₃⁻) и продукты его превращения — это не только субстраты разнообразных реакций азотного обмена, но и регуляторы процессов, прямо не связанных с усвоением азота. Спектр такого рода действия неожиданно оказался весьма широким. Становилась все более очевидной значимость нитрата и его метаболических производных как «гормоноподобных» соединений, способных совместно с продуктами фотосинтеза регулировать экспрессию более чем 50% генома растений, что в итоге определяет особенности их роста, развития и продукционного процесса. Роль нитрата как важнейшего сигнального агента проявляется на этапах его узнавания (sensing), поглощения, транспорта, регуляции общего метаболизма, а также запасания впрок в различных клетках, тканях и органах растений.

Поглощение и транспорт нитрата

Среди первичных клеточных организмов на Земле были, по-видимому, нитрификаторы, окисляющие аммиак до нитрата, и фотосинтезирующие цианобактерии, продуцирующие необходимый для этого кислород. Они и подготавливали основу для дальнейшего развития более разнообразного микробного сообщества. Возникающий в таких условиях нитрат из-за исходно низкой концентрации мог выполнять не столько субстратную, сколько сигнальную роль в живых организмах. По иронии судьбы в природе происходила та последовательность событий, которая была прямо противоположна истории их изучения.

Особенность современной биогеохимической эпохи Земли состоит в высокой вариабельности размеров фондов нитрата в разных типах почв, сопровождающейся перепадами концентрации от 10 мкМ до 100 мМ. Как следствие, растения неизбежно в той или иной степени испытывают дефицит этого источника азота и, не имея возможности передвигаться, вынуждены приспосабливаться к такой нехватке. Их адаптация заключалась в индукции необходимых для узнавания и поглощения нитрата сигнальных систем, которые способствовали максимальному его усвоению для обеспечения роста и развития растений в быстро меняющихся условиях окружающей среды.

Необходимо отметить, что уровень нитрата в почвенном растворе максимален в стадии естественной смены растительности и в сезоны года с оптимальными для роста и развития растений условиями (температура, влажность, аэрация субстрата, отсутствие сомкнутого растительного покрова). Отсюда следует, что узнавание нитрата может использоваться в качестве маркера и своего рода катализатора интенсивного старта вегетации.

Поглощение и распределение нитрата по растению обеспечиваются белками, продуктами пяти генетических семейств, открытых в конце ХХ — начале ХХI в. Эти белки получили название нитратных транспортеров (NitRate Transporter — NRT), и им присвоена последовательная нумерация. Первый из них, NRT1.1, локализован в клетках корня и осуществляет процессы узнавания нитрата, а также первичный акт его поглощения (рис. 1). Оптимальная концентрация его сродства к субстрату невысока и составляет 5–10 мМ. Однако, как было установлено позднее, он может участвовать и при поглощении микромолярных концентраций, что достигается его фосфорилированием. Такого рода механизм особенно важен для узнавания нитрата. Экспрессия гена NRT1.1 (преобразование наследственной информации от гена в функциональный продукт, в данном случае — в белок) достигает максимума в растущих верхушках корней и побегов, а также в цветочных почках, определяя развитие основных вегетативных и генеративных органов растения [1].

Рис. 1. Локализация транспортеров и их участие в переносе нитрата в органах растения. Потоки нитрата: 1 — из почвы в корень; 2 — из коры в ксилему корня; 3 — во флоэму корня с формированием нисходящего тока; 4 — в клетки апекса корня; 5 — в черешки листьев; 6 — во флоэму зрелых листьев и далее в растущую верхушку побега; 7 — в замыкающие клетки устьиц; 8 — в семязачатки; 9 — в вакуоли клеток зародыша; 10 — в клетки почек и растущей верхушки побега

Еще один выявленный транспортер — NRT2.1 — участвует в узнавании и поглощении нитрата как при низких (0,25–1,00 мМ), так и при высоких (5–25 мМ) его концентрациях (см. рис. 1). Однако функции этого транспортера в процессе узнавания, по сравнению с таковыми у NRT1.1, более важны, чем возможность поглощения нитрата при его низком содержании.

Характерная особенность локализованного в клетках поверхности корней и флоэмы побегов транспортера NRT2.4, так же как и NRT2.1, — поглощение низких (менее 0,2 мМ) концентраций нитрата, хотя его сенсорная функция до сих пор не доказана. Ряд транспортеров участвует в межорганном и внутриклеточном распределении нитрата: NRT1.5 — из корня в побег; NRT1.8 — из ксилемы во флоэму корня; NRT1.4 — из побега в черешок листа; NRT1.7 и NRT2.5 — через флоэму из старых листьев в молодые; NRT1.6 — из побега в семязачатки; NRT2.7 — в вакуоли клеток зародыша, что обеспечивает последующее накопление; NRT1.1 — в замыкающие клетки устьиц, регулируя транспирацию листа (см. рис. 1).

Таким образом, если в 1970–1980 гг. высказывались лишь предположения об участии различных гипотетических переносчиков в поглощении и транспорте нитрата, то сейчас известны конкретные белки, действующие в этих процессах. Надо полагать, такая идентификация будет способствовать разработке новых подходов, которые помогут оптимизировать питание культур (поскольку понятна роль обнаруженных транспортеров в распознавании, поглощении разных доз нитрата и его распределении) для получения полноценного экологически безопасного урожая.

Сигнальная регуляция азотного обмена

В 1920-е годы было открыто восстановление нитрата с образованием аммиака. С. П. Костычев (отечественный микробиолог, биохимик, физиолог и ботаник; 1877–1931) обнаружил это у плесневых грибов, а О. Варбург (O. Warburg; немецкий биохимик и физиолог; 1883–1970) — у одноклеточной зеленой водоросли хлореллы. После такого открытия еще долгое время было непонятно, способны ли нитрат и продукты его превращений выполнять роль регуляторов обменных процессов в растении.

Частично ответ на этот принципиальный вопрос был получен экспериментально в 1950–60-е годы. Уже тогда стало очевидным, что NO₃⁻ способен индуцировать активность нитратредуктазы, вызывая ее синтез de novo. Напомним читателю, что речь идет о ферменте, который катализирует первую стадию ассимиляции нитрата — его превращение в нитрит. Образование конечного продукта восстановления — иона аммония (NH₄⁺) — осуществляет фермент нитритредуктаза.

После того как в 1970–1990-е годы в практику исследований вошли специфические ингибиторы трансляции и транскрипции, методы иммунохимического и изотопного анализов, а также клонирование гена нитратредуктазы, вывод о регуляторной функции нитрата был подтвержден. Более того, в данный период установлено, что в клетке существуют два фонда NO₃⁻ — метаболически активный и запасной, причем они пространственно разъединены: первый из них сосредоточен в цитозоле, а второй — в вакуоли. Как выяснилось, именно нитрат первого фонда, значительно меньшего по сравнению со вторым, служит главным регулятором нитратредуктазы [2, 3].

Начиная с 2000-х годов использование дефектных по нитратредуктазе мутантов, у которых субстратная роль NO₃⁻ минимальна, привело к идентификации более 1000 генов, отвечающих на его микромолярные концентрации в течение минутных и часовых экспозиций. Как оказалось, среди этих генов были и те, которые кодируют ферменты дальнейшего метаболизма нитрата: нитритредуктазу, глутаминсинтетазу, глутаматсинтазу. В пользу сигнального характера такого рода эффектов свидетельствует сходство уровня соответствующих транскриптов в широком диапазоне концентраций нитрата: от 0,01 до 10 мМ.

В итоге постепенно стал вырисовываться круг вопросов, относящихся к множественной регуляции нитратом ферментов азотного обмена. Однако возникли другие, не менее сложные для экспериментального разрешения проблемы:

• играют ли, в свою очередь, продукты обмена нитрата (монооксид азота (NO), нитрит, аммоний, глутамат, гамма-аминобутират и др.) роль сигнальных агентов в регуляции метаболизма;
• как сопряжены механизмы их действия с таковыми у нитрата;
• к каким результирующим изменениям роста и развития растений это может приводить.

Таковы задачи предстоящих масштабных исследований, где необходимы новые подходы системной биологии с изучением генных сетей, регулирующих жизнедеятельность растения.

Сигнальная регуляция углеродного обмена

Участие нитрата в первичном углеродном метаболизме. После открытия роли хлоропласта как поставщика не только углерод-, но и азотсодержащих фотоассимилятов [4, 5] в 1970-е годы была выявлена тесная связь между фотосинтезом и обеспеченностью растений азотом, в том числе нитратным. Нитрат оказывает положительное влияние на биосинтез необходимых для фотосинтетической активности ферментов (рибулозобисфосфаткарбоксилазы, фосфоенолпируваткарбоксилазы и дегидрогеназы фосфоглицеринового альдегида) у растений бобов и кукурузы [6].

В последние 15–20 лет экспериментального поиска спектр ферментов углеродного метаболизма, регулируемых нитратом, значительно расширился. У дефицитного по нитратредуктазе табака нитрат в концентрации 12 мМ индуцировал участвующие в обмене органических кислот ферменты: фосфоенолпируваткарбоксилазу, цитозольную пируваткиназу, цитратсинтазу и НАДФ-зависимую изоцитратдегидрогеназу. Но в то же время он подавлял активность ключевого фермента биосинтеза крахмала — АДФ-глюкопирофосфорилазу. В результате накапливался основной углеродный акцептор аммиака — 2-оксоглутарат, а содержание крахмала снижалось [7]. Как выяснили французские исследователи на том же объекте, нитрат в концентрации 10 мМ индуцировал ряд ферментов цикла Кребса (цитратсинтазу, аконитазу, НАД-зависимую изоцитратдегидрогеназу) [8].

У арабидопсиса (растения из семейства капустных) также была обнаружена быстрая (20 мин) индукция нитратом в концентрации 0,25 мМ широкого круга ферментов пентозофосфатного пути (глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, 6-фосфоглюконатдегидрогеназы, трансальдолазы и транскетолазы), гликолиза (глюкозо-6-фосфатизомеразы, фосфоглицератмутазы), а также фосфоенолпируваткарбоксилазы и хлоропластной НАД-зависимой малатдегидрогеназы [9].

Во всех перечисленных примерах есть общая закономерность: нитрат подавляет депонирование углерода (в форме сахарозы и крахмала) и стимулирует наработку необходимых для усвоения азота восстановительных эквивалентов (углеродных акцепторов аммиака), а также органических анионов (малата, или яблочной кислоты), поддерживающих ионный баланс (рис. 2). В итоге создается фундамент для переключения метаболизма в направлении аминокислот, амидов и белка.

Рис. 2. Действие нитрата на первичный метаболизм. Красными стрелками обозначены метаболические пути; синими — позитивное сигнальное действие нитрата; коричневыми — негативное. АДФГ-ПФ — АДФ-глюкопирофосфорилаза; ГОГАТ — глутаматсинтаза; ГС — глутаминсинтетаза; ИЦДГ — изоцитратдегидрогеназа; НиР — нитритредуктаза; НР — нитратредуктаза; ПК — пируваткиназа; РБК — рибулозобифосфаткарбоксилаза; СФС — сахарозофосфатсинтаза; ФГА — фосфоглицериновый альдегид; ФЕП — фосфоенолпируват; ФЕПК — ФЕП-карбоксилаза; ЦС — цитратсинтаза

Влияние на стартовые ферменты метаболизма углеводов. К настоящему времени получены первые свидетельства того, что от присутствия нитрата зависит активность стартовых ферментов диссимиляции основных депо углерода клетки — сахарозы и крахмала. Так, уже при концентрации нитрата 10 мМ усиливалась светозависимая утилизация крахмала при весеннем выходе из покоя многокоренника (представителя подсемейства рясковых) [10]. В наших опытах нитрат стимулировал и независимое от света прорастание гороха посевного. Кроме того, в первые 24 ч прорастания он уже при концентрации 1 мМ стимулировал в корнях и зародышевых осях гороха активность сахарозосинтазы, сохраняющуюся при последующем переходе к автотрофии [11, 12]. Повышение активности сахарозосинтазы in vitro в диапазоне концентраций иона до 5 мМ с выходом на плато при 5–50 мМ характерно для сигнальных эффектов нитрата. Можно предположить, что сахарозосинтаза входит в круг первичных его мишеней — сенсоров. Альтернативные ферменты диссимиляции (распада) сахарозы — кислая и щелочная инвертазы — не были приоритетными мишенями нитрата.

В регуляции нитратом сахарозосинтазы в корнях есть вклад и второй составляющей — сахарозы [11]. В частности, нитратзависимая стимуляция фермента четко проявлялась при достаточной для фотосинтеза освещенности растений гороха (18–20 клк), но не при световом дефиците (3–6 клк). Одна из возможных причин этого — индукция сахарозой транспортеров и рецепторов нитрата, например, NRT1.1, NRT2.1. В результате создается основа для узнавания указанного иона как непосредственно на плазмалемме, так и внутри клетки. В последнем случае можно предположить, что рецептор поступившего в цитозоль нитрата — сахарозосинтаза.

Дискриминация стартовых ферментов метаболизма сахарозы как мишеней нитрата может быть связана с их биохимической спецификой. Сахарозосинтаза служит важным звеном в наработке УДФ-глюкозы, субстрата для широкого круга биосинтезов. В их числе — образование структурных компонентов апопласта (целлюлозы, каллозы, гемицеллюлоз и пектинов), сахарозы, глико- и сульфолипидов, гликопротеидов, гликозилированных фенольных соединений, а также конъюгированных форм фитогормонов и выполняющего важную сигнальную роль трегалозо-6-фосфата. Методами масс-спектрометрии и иммунохимии доказано, что значительная часть белка сахарозосинтазы находится в комплексе с целлюлозосинтазой и/или каллозосинтазой, обеспечивая субстратом рост клеточной стенки. Это также подтверждает предположение о непосредственном участии сахарозосинтазы в нитратзависимом накоплении фитомассы.

Таким образом, положительное сигнальное действие нитрата на сахарозосинтазу создает основу для субстратного обеспечения не только азотного обмена, но и других реакций образования структурных и сигнальных компонентов растительной клетки (рис. 3). Как следствие, формируется метаболический фундамент для нитратзависимой интенсификации ростовых процессов. Утилизация крахмала, зависимая от нитрата, обеспечивает стартовое наполнение пула сахарозы уже в начальный гетеротрофный период онтогенеза. Этим создается основа не только для разнообразных реакций углеродного обмена, но и для сигнального действия нитрата, его узнавания и транспорта.

Рис. 3. Действие нитрата на стартовые ферменты метаболизма углеводов. Значения стрелок — как на рис. 2. Потоки: 1 — нитрата по ксилеме, 2 — сахарозы по флоэме. АМ — α-амилаза, СС — сахарозосинтаза

Сигнальная регуляция вторичного углеродного метаболизма. Для утилизации нитрата необходимы восстановительные эквиваленты и акцепторы аммиака. Однако требующиеся для их образования углеродные субстраты также участвуют в процессах депонирования запасных углеводов и образования многих вторичных метаболитов, прежде всего фенольной природы. Негативное действие нитрата на реакции фенольного обмена было доказано в последнее десятилетие. Так, у табака нитрат в концентрации 12 мМ репрессировал широкий круг ферментов фенилпропаноидного метаболизма (фенилаланинаммиаклиазу, 4-кумарат-КоА-лигазу, хиннатоксициннамоилтрансферазу и др.), у арабидопсиса (в концентрации 10 мМ) — все ферменты пути синтеза антоцианов. В итоге в обоих случаях уменьшалось содержание фенолокислот, флавоноидов и лигнина.

Кроме того, как выявлено на примере арабидопсиса, уже в концентрации 3 мМ нитрат подавляет образование только антоцианов, но не других флавоноидов или лигнина. Вероятно, большинство фенилпропаноидных метаболитов выполняет ряд важных функций, в том числе обеспечение механической прочности тканей, иммунитет к патогенам и снижение пищевой привлекательности для фитофагов. Растения адаптировались к поддержанию необходимой интенсивности большинства реакций фенольного метаболизма при концентрациях нитрата, характерных для их местообитаний. Напротив, накопление антоцианов — это, скорее всего, специфическая защитная реакция в ответ на существенный дефицит азота, распространившаяся в процессе эволюции на сезоны годичного цикла и/или на фазы развития растения, когда концентрации доступного клеткам листа нитрата минимальны.

***

Таким образом, выявление значительного количества ферментов углеродного и азотного метаболизмов как мишеней действия нитрата, несомненно, приведет к формированию нового раздела в физиологии и биохимии растений. Если бы растения эволюционно не выработали способность усваивать NO₃⁻, ответ их генома на дефицит или возрастающие концентрации этого иона в среде представлял бы собой сигнальный механизм, аналогичный тому, каким мы его представляем ныне. Изменение уровня реакции множества генов приводит к тем физиологическим переменам, которые характеризуют нитрат не только как субстрат, но и как важнейший регулятор общего метаболизма, а также баланса азота и углерода. Однако роль нитрата в растении этим не ограничивается. Он ответствен за многие гормональные и морфогенные изменения, которые в конечном итоге обеспечивают рост, развитие и продукционный процесс растительного организма.

Литература
1. Guo F.-Q., Wang R., Chen M., Crawford N. M. The Arabidopsis dual-affinity nitrate transporter gene AtNRT1.1 (CHL1) is activated and functions in nascent organ development during vegetative and reproductive growth // Plant Cell. 2001; 13: 1761–1777. DOI: 10.1105/TPC.010126.
2. Измайлов С. Ф. Азотный обмен в растениях. М., 1986.
3. Измайлов С. Ф. Насыщение и использование фондов нитрата в листьях гороха и сахарной свеклы // Физиология растений. 2004; 51(2): 211–216.
4. Ничипорович А. А. Фотосинтез и теория получения высоких урожаев // 15-е Тимирязевские чтения. М., 1956.
5. Bassham J. A., Kirk M. Photosynthesis of amino acids // Biochim. Biophys. Acta. 1964; 90(3): 553–562.
6. Авдеева Т. А., Андреева Т. Ф., Ничипорович А. А. Влияние азотного питания на фотосинтез, активность карбоксилирующих ферментов и дегидрогеназы фосфоглицеринового альдегида у растений бобов и кукурузы, выращенных при разной интенсивности света // Физиология растений. 1974; 21(2): 308–314.
7. Scheible W. R., Gonzalez-Fontes A., Lauerer M. et al. Nitrate acts as a signal to induce organic acid metabolism and repress starch metabolism in tobacco // Plant Cell. 1997; 9: 783–798. DOI: 10.1105/tpc.9.5.783.
8. Lancien M., Ferrario-Mery S., Roux Y. et al. Simultaneous expression of NAD-dependent isocitrate dehydrogenase and other Krebs cycle genes after nitrate resupply to short-term nitrogen-starved tobacco // Plant Physiology. 1999; 120: 717–726. DOI: 10.1104/pp.120.3.717.
9. Wang R., Okamoto M., Xing X., Crawford N. M. Microarray analysis of the nitrate response in Arabidopsis roots and shoots reveals over 1,000 rapidly responding genes and new linkages to glucose, trehalose-6-phosphate, iron, and sulfate metabolism // Plant Physiology. 2003; 132: 556–567. DOI: 10.1104/pp.103.021253.
10. Appenroth K. J., Ziegler P. Light-induced degradation of storage starch in turions of Spirodela polyrhiza depends on nitrate // Plant, Cell & Environment. 2008; 31: 1460–1469. DOI: 10.1111/j.1365-3040.2008.01855.x.
11. Брускова Р. К., Никитин А. В., Сацкая М. В., Измайлов С. Ф. Действие нитрата на активность сахарозосинтазы растений гороха // Физиология растений. 2009; 56: 85–91.
12. Никитин А. В., Измайлов С. Ф. Ферменты диссимиляции сахарозы как мишени действия нитрата в раннем онтогенезе гороха посевного // Физиология растений. 2016. 63: 159–164.