Синтезом белков можно управлять с помощью света

Рис. 1. Схема каскадов, происходящих в экспериментальных клетках в ответ на освещение. Под действием синего света (Blue light) меланопсин (melanopsin) меняет свою пространственную конформацию, из-за чего активируется связанный с ним G-белок Gαq-типа (Gαq). G-белок через цепочку посредников (PLC — фосфолипазу С и PKC — протеинкиназу С) вызывает выброс ионов кальция (Са²⁺) из внеклеточного пространства через TRPC-каналы (см. TRPC) и, возможно, из эндоплазматического ретикулума (ER). Ионы кальция активируют белок кальмодулин (calmodulin) (этот белок знаменит своей вездесущестью — он встречается вообще во всех эукариотических клетках). Кальмодулин активирует белок кальциневрин (см. Calcineurin). Кальциневрин — это фосфатаза; он дефосфорилирует транскрипционный фактор NFAT, в результате чего у NFAT-а меняется пространственная конформация и выпячивается наружу сигнал ядерной локализации (см. nuclear localization signal; о том, что такое NLS и как вообще проходит ядерный импорт см. Уточнен механизм ядерного транспорта, «Элементы», 25.09.2010). В результате NFAT из цитоплазмы (Cytoplasm) попадает в ядро (Nucleus), где присоединяется к специфическим промоторам (P_NFAT), что и вызывает трансляцию генов (Transgene), находящихся под этими промоторами. Изображение из обсуждаемой статьи в Science

Сделан еще один шаг по направлению к миру будущего. Научная группа под руководством швейцарского исследователя Мартина Фуссенеггера разработала новую методику, находящуюся на стыке оптогенетики и синтетической биологии. Эта методика позволяет выводить линии клеток, которые производят те или иные вещества в ответ на изменение освещения. Методика может оказаться очень полезной не только в науке, но и в фармацевтике и медицине.

Оптогенетика — это совсем недавно разработанная методика, восхитительная по своему изяществу, которая буквально перевернула определенные области биологии. Суть ее в следующем.

Существует особая группа клеточных рецепторов под названием «опсины». Рецепторы эти светочувствительные, то есть, если их осветить, они через систему веществ-посредников запускают определенные цепочки реакций, в результате которых клетка возбуждается. У позвоночных опсины находятся в светочувствительных нейронах в сетчатке; благодаря им мы видим. (В организме опсины синтезируются на основе витамина А; именно поэтому он так важен для зрения.)

Те вещества-посредники, которые обеспечивают возбуждение клетки в ответ на освещение, есть и в других клетках, не только светочувствительных. Поэтому если искусственно встроить опсин в несветочувствительный нейрон, то и он тоже начнет возбуждаться под действием света. Больше того, некоторые опсины могут не возбуждать, а, наоборот, тормозить клетки. В результате ученые получают возможность практически произвольно «включать» или «выключать» те или иные группы нейронов, всего лишь освещая их (например, с помощью лазера). При этом подопытное животное практически интактно — оно не зафиксировано в специальных установках, может свободно двигаться, и за его поведением можно без проблем наблюдать. А главная прелесть в том, что оптогенетические методики дают исследователям невиданную прежде точность измерения — буквально до миллисекунды.

Однако почему бы не пойти еще дальше? Что если встроить опсины в невозбудимую клетку? Если после этого клетку осветить, она, конечно, не возбудится (этого она не умеет), но можно попытаться заставить ее производить какие-нибудь вещества, которые в норме для нее нехарактерны.

Именно эту задачу поставили перед собой исследователи из группы Мартина Фуссенеггера. Для своих экспериментов они выбрали меланопсин. Этот опсин не встречается в палочках и колбочках и не имеет отношения к зрению. Он экспрессируется ганглиозными клетками сетчатки (см. Photosensitive ganglion cell) и участвует в так называемых незрительных ответах на свет — подгонке суточных ритмов к световому дню, зрачковом рефлексе (см. Pupillary light reflex) и так далее (подробнее о суточных ритмах и влиянии на них освещения см.: Синий и зеленый свет будят человека по-разному,«Элементы», 04.06.2010).

Меланопсин был выбран потому, что он обладает очень подходящими для планируемых экспериментов свойствами. Из-за того что он не участвует в процессах зрения, он может гораздо дольше выдерживать гораздо более яркий свет, чем другие опсины. То есть его можно безбоязненно освещать довольно длительное время, что очень удобно, если мы собираемся создать клетки, в которых под действием света будут вырабатываться какие-то вещества. К тому же, меланопсин чувствителен исключительно к синему свету, а значит, никакой другой «случайный» свет его не «разбудит».

Пока что, к сожалению, довольно плохо изучено, какие каскады реакций запускаются в клетке в ответ на активацию меланопсина. Однако кое-что известно абсолютно точно: одно из последствий этой активации — повышение внутриклеточного уровня ионов кальция. А раз так — становится очень просто заставить клетку производить нужные вещества. Достаточно подобрать такой каскад реакций, который, во-первых, будет запускаться при повышении концентрации кальциевых ионов, а во-вторых — будет приводить к активации какого-нибудь транскрипционного фактора.

Транскрипционный фактор — это белок, который запускает (или, наоборот, запрещает) транскрипцию генов, находящихся под контролем соответствующих промоторов. Если теперь нам понадобится запустить синтез того или иного белка, нам достаточно будет поставить кодирующий его ген под контроль нужного промотора, а затем осветить клетку. В данном случае исследователи использовали транскрипционный фактор по имени NFAT(Nuclear factor of activated T-cells) и его промоторы P_NFAT.

Первым делом исследователи убедились, что придуманная ими схема вообще работает. Для этого они ставили под контроль NFAT-ного промотора разные гены и проверяли уровень их экспрессии в ответ на освещение клеток. Один из полученных результатов — с геном EYFP, одного из подвидов желтого флюоресцирующего белка, — показан на рис. 2. Видно, что опытные клетки (которых освещали) и контрольные (которых держали в темноте) показывают совершенно разную флюоресценцию — а значит, и разный уровень экспрессии белка.

Рис. 2. Опытные клетки (нижний ряд), которые освещались пульсирующим синим светом (Blue-light pulse), показывают высокий уровень экспрессии EYFP и поэтому сильно флюоресцируют. В то же время контрольные клетки (верхний ряд), которые держали в темноте (No light), практически не флюоресцируют. Изображение из обсуждаемой статьи в Science

Всё это говорило о том, что методика работает. Поэтому исследователи попробовать решить с ее помощью несколько прикладных задач.

Первая из этих задач была такова. Существует много лекарств, созданных на основе белков. Синтез этих белков производится специальными клеточными линиями. Однако многие из таких белков (например, те, которые используются в противораковой терапии), токсичны для синтезирующих их клеток. Поэтому для того, чтобы клетки не погибли, производя необходимое вещество, приходится постоянно следить за их состоянием и то включать, то выключать в них экспрессию нужных генов. Эти включения и выключения довольно трудоемки, а кроме того, часто вызывают в клетках нежелательные изменения. Однако всё станет гораздо проще, если мы сможем «включать» и «выключать» экспрессию нужных генов всего лишь с помощью изменения режима освещения. Исследователи проверили, подходит ли придуманная ими методика для решения данной задачи, и остались довольны результатом (см. рис. 3).

Рис. 3. Синтез белка SEAP (человеческой плацентарной секретируемой щелочной фосфатазы), поставленного под контроль NFAT-ного промотора, проводился в биореакторе клетками линии HEK-293, которых «заставили» экспрессировать меланопсин. Видно, что под действием пульсирующего синего света (Blue light pulse) синтез проходит прекрасно, в то время как в темноте (No light) белок практически не синтезируется. Изображение из обсуждаемой статьи в Science

Вторая задача, которую ученые попробовали решить с помощью данной методики, была еще интереснее и амбициознее.

Почему бы не сделать так, чтобы те или иные вещества в ответ на освещение производили клетки не из пробирки, а из живого организма? Это облегчило бы многие эксперименты с животными, а кроме того, устроило бы настоящий переворот в медицине. Представьте себе: лечение больного проходит без таблеток и инъекций. У него берут некоторое количество клеток, вставляют в них опсины, ставят синтез необходимых для лечения белков под контроль соответствующих промоторов, а затем вживляют клетки назад и управляют синтезом белков, просто освещая клетки (например, с помощью лазера).

Ученые убедились в том, что их методика работает в масштабе целого организма, а затем провели пилотное исследование, в котором попробовали с помощью своей методики вылечить мышей от диабета.

Для этого они использовали глюкагоноподобный пептид-1 (ГПП-1) — пептидный гормон, который усиливает секрецию инсулина и поэтому может быть использован для лечения диабета II типа. Экспрессию этого пептида в культуре клеток они сделали зависимой от света, а затем вживили эти клетки под кожу мышам линии db/db, которая является моделью диабета. После этого мышей в течение двух суток освещали пульсирующим синим светом, а затем измерили уровень инсулина и глюкозы в их крови (см. рис. 4). Результаты были вдохновляющими — методика работала.

Рис. 4. Уровень глюкозы (Blood glucose) в крови диабетических мышей, которым вживили клетки, экспрессирующие глюкагоноподобный пептид 1 в ответ на освещение, после 48 часов освещения пульсирующим синим светом (Blue light pulse, опыт) или без освещения синим светом (No light, контроль). По горизонтальной оси время в минутах. Видно, что у опытных мышей уровень глюкозы ниже, чем у контрольных. Изображение из обсуждаемой статьи в Science

Конечно, эта методика еще совсем новая и таит в себе множество коварных подводных камней. Пожалуй, самый главный и опасный из них — то, насколько слабо изучены каскады, запускаемые в клетке активацией меланопсина. Ведь помимо запрограммированного нами синтеза белков в клетке в ответ на освещение может произойти огромное количество других событий, многие из которых окажутся для нас совершенно нежелательными. Однако будем надеяться, что все трудности будут разрешены, и эта великолепная методика скоро встанет на вооружение ученых.

Источник: Haifeng Ye, Marie Daoud-El Baba, Ren-Wang Peng, Martin Fussenegger. A Synthetic Optogenetic Transcription Device Enhances Blood-Glucose Homeostasis In Mice // Science. 2011. V. 332. P. 1565–1568.

Вера Башмакова