Новые подходы к созданию иммуногена для ВИЧ-вакцины
Андрей Взоров
«Природа» №11, 2018
 Об автореАндрей Николаевич Взоров — доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории энзимологии Института вирусологии имени Д. И. Ивановского при НИЦЭМ имени Н. Ф. Гамалеи, профессор кафедры иммунологии биологического факультета МГУ имени М. В. Ломоносова. Область научных интересов — изучение поверхностных белков ВИЧ и их способности вызывать иммунные ответы, а также конструирование вирусоподобных частиц для создания безопасных вакцин. |
Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) — один из самых изученных вирусов. Почему же при этом он остается неуязвимым? Поиском «ахиллесовой пяты» ВИЧ и новых подходов к созданию вакцины занимаются во множестве лабораторий мира, но, несмотря на значительные успехи в этой области, найти надежный способ борьбы с ВИЧ-инфекцией пока не удалось. Сложность заключается в том, что стратегия, на основе которой разработано более половины лицензированных к настоящему времени вакцин, в случае ВИЧ-инфекции не работает.
Для профилактики вирусных инфекций в качестве иммуногена используются инактивированные (в случае полиомиелита, гриппа, бешенства, гепатита А) или живые, но ослабленные (корь, краснуха, эпидемический паротит, желтая лихорадка) формы вируса или конструкции из фрагментов антигена (гепатит В, папилломавирусная инфекция, грипп), которые обеспечивают достаточно надежный гуморальный иммунный ответ. Все вакцинные препараты против ВИЧ, созданные с помощью традиционного подхода, оказались неэффективными из-за мощной защиты вируса от нейтрализующего действия антител. Устойчивость ВИЧ связана с биологическими свойствами гликопротеина Env, из которого образованы шипы на вирусной оболочке*. На поверхности Env находится множество гликанов, которые оберегают потенциально уязвимые области гликопротеина от T- и B-клеток; часть функциональных областей Env скрыта от антител гибкими вариабельными петлями.
Со временем стало ясно, что для создания иммунитета к ВИЧ-инфекции необходимо использовать новые формы оболочечного белка — модифицированные тримеры Env. В последнее время для конструирования таких Env-иммуногенов используются методы структурной биологии, которые позволяют преодолеть механизмы ускользания ВИЧ. Принципиально новая стратегия создания (или дизайна, как принято теперь говорить в профессиональной среде) иммуногена разработана на основе Env-тримера ВИЧ-1 (самого распространенного сейчас типа ВИЧ) в составе вирусоподобных частиц (VLP, от англ. virus-like particle). Научная новизна подхода заключается в том, что сконструированы стабилизированные шипы-тримеры Env ВИЧ-1, обладающие уникальными иммунологическими свойствами, с раскрытием новых консервативных эпитопов для нейтрализующих антител. Эти антитела способны ингибировать наиболее устойчивые штаммы ВИЧ, в частности CCR5-тропный трансмиссивный штамм-основатель, который передается половым путем через слизистые (мукозные) оболочки и отвечает за начало инфекции.
Типы антител к ВИЧ и их отличия
Известно, что ВИЧ может распространяться как свободными, так и связанными с клетками вирусными частицами, поэтому и препятствовать этому должны такие иммунные механизмы, которые действуют на вирионы как вне, так и внутри клетки. На слизистых поверхностях в качестве первой линии обороны выступают иммуноглобулины класса А (IgA), которые синтезируются в основном плазматическими клетками мукозных оболочек. Эти секреторные иммуноглобулины обязаны препятствовать проникновению вирусов в организм, связываясь непосредственно с антигеном с помощью Fab (от англ. antigen binding fragment — ‘антигенсвязывающий фрагмент’). Присутствие IgA у людей, которые находятся в постоянном контакте с ВИЧ, но при этом у них не определяются специфические к нему антитела, свидетельствует о возможной роли IgA в защите от ВИЧ-инфекции. Кроме того, эти антитела несут дополнительную ингибирующую функцию, связанную с Fc-областью (Fc, от англ. fragment crystallizable — ‘кристаллизующийся фрагмент’). В слизистой оболочке IgA могут запускать локальные иммунные механизмы (секреторный компонент IgA-опосредованной защиты мукозных клеток, агрегацию секреторных IgA) или активировать эффекторные клетки ADCC (от англ. antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity — ‘антителозависимая клеточнообусловленная цитотоксичность’), которые синтезируют Fсα-рецепторы (например, нейтрофилы). Недавно, при испытании вакцины RV144, показано, что отсутствие защиты от заражения ВИЧ связано с уровнем индуцирования IgA в сыворотках. В процессе ADCC анти-ВИЧ-IgA конкурируют с IgG, что снижает защитные функции последних. Иными словами, в зависимости от локализации и структуры IgA, а также их происхождения (например, индуцированы они вакциной или ранее существовали), эти антитела могут оказывать либо негативный эффект, конкурируя с протективными антителами IgG, либо позитивный, проявляя защитный эффект путем ингибирования передачи ВИЧ через слизистую оболочку. Эта двойственная функциональность IgA еще раз напоминает нам о сложнейших механизмах, регулирующих иммунный ответ и модулирующих активность его участников, что необходимо учитывать при создании анти-ВИЧ вакцины.
Не менее важны в предотвращении инфицирования свободными вирионами ВИЧ-1-специфические IgG, которые участвуют в адаптивном иммунном ответе. ВИЧ-1-специфические IgG наряду с Fab-фрагментом также могут использовать Fc-область, взаимодействуя с Fcγ-рецепторами (FcγR) на поверхности иммунных клеток для их активации. Оба типа иммуноглобулинов, нейтрализующие антитела (nAbs, от англ. neutralizing antibodies) — nAbs и защитные FcγR-опосредующие pnnAbs (protective non-neutralizing antibodies) — ненейтрализующие антитела, способны ингибировать внеклеточный вирус и вирус, которому уже удалось проникнуть в клетку, соответственно (рис. 1) [1].
В экспериментах по передаче химерного вируса SHIV (от англ. simian-human immunodeficiency virus), представляющего собой комбинацию генов вирусов иммунодефицита обезьян (SIV) и человека (HIV), было показано, что введение специфических nAbs макакам полностью предотвращает их инфицирование [2]. Тем не менее, у суперинфицированных (повторно зараженных) пациентов были обнаружены nAbs, которые могли in vitro (в лабораторных условиях) нейтрализовать вторичные вирусные штаммы, вызывающие повторное заражение. Это указывает на недостаточный уровень nAbs для блокирования инфекции во время естественной инфекции. При вакцинации людей для профилактики ВИЧ-инфекции скорее всего потребуются nAbs с широким действием и с более высокой концентрацией, чем у инфицированных ВИЧ-1.
При сравнении функций нейтрализующих антител широкого спектра действия (bnAbs, от англ. broadly nAbs), которые призваны блокировать ВИЧ, с защитными ненейтрализующими антителами (pnnAbs), которые «метят» вирус или инфицированную клетку для активации иммунной системы, выявлены существенные различия [3]. Во-первых, для созревания bnAbs требуются годы [4], а для pnnAbs — только недели. Во-вторых, нейтрализующие антитела достигают широты действия приблизительно у 20% ВИЧ-инфицированных, а защитные — у 100%. В-третьих, для обеспечения широты действия bnAbs необходим уровень мутаций в Fab-области 10–30%, а для pnnAbs достаточно всего 1–5%. В-четвертых, для нейтрализующих антител обнаружено 5 подходящих эпитопов, а для защитных, по разным данным, от 6 до 57. Таким образом, любые антитела, связывающиеся с Env и выставляющие геометрически правильно свою область Fcγ, способны активировать врожденный иммунный ответ. В-пятых, нейтрализующие антитела не разрушают клетки, инфицированные ВИЧ, а защитные — разрушают. В-шестых, pnnAbs, в отличие от bnAbs, вызывают секрецию цитокинов, и для функционирования защитных антител необходимы эффекторные клетки. И наконец, вызвать выработку широко нейтрализующих антител в ответ на введение вакцины еще не удалось, а индукция защитных антител уже достигнута в нескольких доклинических исследованиях [5].
Эффективность подавляющего большинства человеческих вакцин связана с ответами антител, индукция которых при вакцинации зависит от особенностей иммунной системы и от иммуногена. ВИЧ относится к вирусам, против которых при естественной инфекции чрезвычайно трудно вызвать эффективный ответ антител, способный защитить от инфекции. При естественной ВИЧ-инфекции изолированные антитела нейтрализуют более 90% циркулирующих изолятов ВИЧ, но для созревания этих антител может потребоваться создание необычных условий.
К настоящему времени проведено шесть испытаний эффективности вакцин против ВИЧ, в которых проанализированы вакцины на основе потенциальных антигенов ВИЧ (Env, Gag и др.), базирующиеся на четырех различных концепциях [5]. Однако приемлемый уровень эффективности зарегистрирован только для вакцины RV144, которая фактически сочетает два компонента: для стимуляции Т-клеточного ответа был использован рекомбинантный вирус оспы канареек, экспрессирующий гены env, gag и протеазы ВИЧ-1, — ALVAC-HIV [vCP1521], а для усиления иммунного ответа (бустерной вакцинации) — препарат AIDSVAX B/E на основе гликопротеина gp120 ВИЧ-1. Клинические исследования RV144 завершились в 2009 г., и выяснилось, что в первый год испытаний вакцина обеспечивала защиту на уровне 60%, после чего концентрация ВИЧ-специфических антител в крови иммунизированных падала и эффективность этой вакцины в предотвращении ВИЧ-инфекции снижалась до 31,2%. С одной стороны, это беспрецедентный прорыв и безусловный успех, а с другой — это слишком низкий показатель для внедрения RV144 в широкую практику. Причина невысокого уровня защиты от ВИЧ, по-видимому, связана с бустирующим компонентом вакцины и обусловлена неспособностью антител ингибировать первичные ВИЧ-1-изоляты с гипервариабельными gp120-белками.
В экспериментах на макаках-резусах выявлена зависимость успешной и безуспешной индукции нейтрализующих антител против ВИЧ от иммунологических барьеров, которые изучали с помощью набора методов, в том числе прямого зондирования зародышевого, или герминативного, центра (GC, от англ. germinal center) лимфатических узлов [6]. У 9 из 12 животных (75%), иммунизированных Env-тримером ВИЧ (SOSIP.v5.2), образовывались нейтрализующие nAbs против ВИЧ с умеренным уровнем резистентности (tier 2), при этом общие титры анти-Env-антител у всех животных были одинаковые. Образование антител связано с характеристиками фолликулярных Т-хелперов (Tfh, от англ. follicular T helper — субпопуляция CD4+ T-клеток), специфичных для Env, а также с частотой В-клеток герминативного центра и соотношением к его Tfh-клеткам. Может ли иммунизация индуцировать антитела, используя иные, более эффективные пути, чем естественная инфекция?
Преодолеть иммунологические барьеры в индукции bnAbs у ВИЧ-инфицированных пытаются с помощью линейной В-клеточной вакцины. В основе ее создания лежит конструирование иммуногенов, нацеленных на bnAbs-предшественники [7]. Поскольку нативные (не модифицированные) Env-тримеры ВИЧ-1 могут индуцировать аутологичные nAbs (направленных только против собственного иммуноварианта Env, использованного для иммунизации), можно имитировать процесс формирования bnAbs, используя для этого модифицированные тримерные варианты Env и специальные схемы иммунизации. Линейные иммуногены могут вызвать образование bnAbs в специализированных линиях трансгенных (knock-in) мышей, однако в присутствии полного герминативного репертуара человека ожидаемый ответ будет сопровождаться индукцией дополнительных иммунодоминантных nnAbs, которые могут блокировать образование нейтрализующих антител.
Эффективность bnAbs и pnnAbs
Изучение нейтрализующих антител связано с историей их получения от ВИЧ-инфицированных. Первое поколение нейтрализующих антител широкого спектра действия (bNAbs) получено с помощью методов фагового дисплея и гибридомной технологии в 1990-х годах. Открытие bNAbs привело к идентификации консервативных эпитопов, которые явлются общими у подтипов ВИЧ и включают: сайт связывания с CD4 (CD4 binding site, CD4bs) на gp120 и соответствующие антитела; консервативные эпитопы в мембрано-проксимальной области (MPER, от англ. membrane proximal external region) gp41, которые нейтрализуют антитела 4E10 и 2F5; гликановый эпитоп на внешнем домене gp120, с которым связывается антитело 2G12. Отбор (скрининг) антител проводился с использованием мономерного gp120, поэтому все они распознают консервативные аминокислотные последовательности на одиночном протомере gp120 и частично представленные (т.е. не полностью закрытые тримерными структурами Env) у вирусных изолятов, которых они нейтрализуют. Поэтому антитела первого поколения имеют ограничение по широте действия и/или специфической активности против ВИЧ-1: b12 и 2G12 нейтрализуют примерно 30% циркулирующих штаммов ВИЧ-1, а 4E10 — около 95%, но только при средних концентрациях ингибирования (inhibition concentration, IC50), превышающих 1 мкг/мл.
К открытию более мощных и более широкого спектра действия bnAbs привели два основных события. Во-первых, в результате масштабных исследований инфицированных людей из стран Африки найдены оптимальные условия для выявления и изоляции сильных нейтрализующих bnAbs. Во-вторых, были усовершенствованы подходы к получению человеческих моноклональных антител. Для отбора сывороток, содержащих высокоактивные нейтрализующие антитела, использовались оптимизированные методы культивирования и активации индивидуальных В-клеток памяти. Гены антител, отобранных из положительных образцов, клонировали в подходящих векторах для получения bnAbs. Другой используемый подход базировался на основе Env-специфической сортировки В-клеток и получении генов антител, а затем уже использование скрининга полученных антител на нейтрализующую активность. Нейтрализующие антитела второго поколения (VRC01 и PGV04) более точно нацелены на CD4bs и имеют значительную широту и эффективность (рис. 2). Более мощные антитела PG9/PG16 — на структуру вариабельных петель V1/V2 на вершине тримера через гликан N160. Антитела PGT123 — наиболее мощные из идентифицированных — успешно взаимодействуют с основанием V3-петли, включая гликаны в N301 и N332.
Рис. 2. Экспериментально обоснованная модель связывания bnAbs с тримером Env, полученная с помощью электронной микроскопии. В соответствии с эпитопами, которые распознают bnAbs, их можно разделить на следующие группы: антитела, связывающиеся с вершиной тримера (а), с высокоманнозным участком (б), с сайтом связывания CD4 (в), с поверхностью соединения gp120-gp41 (г) и областью MPER на поверхностном домене gp41 (д). DOI: 10.1146/annurev-immunol-041015-055515
Антитела к разным уязвимым сайтам Env-тримера отличаются друг от друга активностью на мукозной оболочке [8]. Способность bnAbs и pnnAbs (включая те, защитный эффект которых проявился в клинических исследованиях вакцины RV144) блокировать размножение и распространение ВИЧ-1 сравнивали на моделях клеток и тканей мукозной оболочки. Специфические bnAbs против CD4bs (VRC01) нейтрализовали ВИЧ-1 во всех клеточных и тканевых моделях. Антитела к MPER (2F5) и к наружной гликановой области (2G12) предотвращали инфицирование мукозных тканей, а эффективность bnAbs, нацеленных на гликаны V1–V2 (PG9 и PG16), была неполной. Активные в ряде клеточных анализов pnnAbs (самостоятельно и в комбинациях) плохо защищали ткани слизистой оболочки от ВИЧ-1-инфекции. Эти данные свидетельствуют о том, что недостаточное количество эффекторных клеток в мукозной тканях и Fc-рецепторов ограничивают потенциал pnnAbs в предотвращении образования начальных очагов ВИЧ-1-инфекции. Специфические bnAbs превосходят pnnAbs по эффективности защиты слизистых оболочек от инфицирования ВИЧ-1.
Общая мера эффективности pnnAbs определяется их плотностью связывания с антигенами (авидностью), которая имеет решающее значение для запуска антителозависимых клеточных механизмов — фагоцитоза (ADCP, от англ. antibody-dependent cellular phagocytosis), цитотоксичности (ADCC) и ингибирования клеточного вируса (ADCVI, от англ. antibody-dependent cell-mediated virus inhibition). В экспериментах по предупреждению инфекции оказалось, что авидность индуцированных Env-специфических антител против белка Env вируса SIVsmE660, использованного для заражения, сильно связана с защитным эффектом этих антител. Так, животные, у которых показатели авидности ≥40, не были инфицированы, тогда как у других, с индексами <40, наблюдалась сильная корреляция между индексом авидности и количеством контрольных лабораторных заражений, требуемых для начала инфекции. У обезьян с усиленной реакцией антител (в частности, с высокоавидными Env-специфическими IgG) после лабораторных высокодозных ректальных заражений SIV или химерным SHIV наблюдалось значительное (102–105-кратное) снижение пика виремии по сравнению с животными, у которых антитела имели низкую авидность [3].
Защитные антитела играют решающую роль в предупреждении передачи ВИЧ-1 от инфицированных матерей новорожденным. Установлено, что 60% младенцев, появившихся на свет у таких женщин, не заражаются ВИЧ ни во время внутриутробного развития, ни при прохождении по родовым путям, ни в период грудного вскармливания. У всех младенцев, независимо от того, заразились они ВИЧ или нет, были обнаружены одинаково низкие уровни нейтрализующих и защитных антител в плазме крови. В грудном молоке были обнаружены низкие уровни специфических анти-Env IgG и IgA с ограниченной нейтрализующей активностью. Ингибировали передачу ВИЧ от матери ребенку защитные антитела с высокой ADCC, обнаруженные в грудном молоке [9].
До недавнего времени оставалось неясно, будут ли bnAbs защищать от заражения внутриклеточным вирусом. Очевидно, высокоинфекционный ВИЧ, связанный с клетками и присутствующий во всех биологических жидкостях, потенциально способен уклоняться от нейтрализации антителами. Для оценки, могут ли bnAbs второго поколения предотвращать инфекцию после заражения внутриклеточным вирусом, использовали антитела PGT121 с комбинированным механизмом действия: они распознают эпитоп, находящийся на V3-петле, и опосредуют ADCC (см. рис. 1). Вначале макакам вводили PGT121, а через час — внутривенно зараженные SHIV клетки (SHNSF162P3-инфицированные спленоциты). В результате всех подопытных животных PGT121 полностью защитили от внеклеточного вируса, троих из шести — и от внутриклеточного SHIV, а у остальных развилась высокой виремия, но с некоторой отсрочкой (у двух — недельной и у одного — семинедельной). Антитела PGT121 были обнаружены через семь дней после введения в плазме крови всех инфицированных животных, но в разной концентрации — от 0,3 до 4 мг/мл. Самые низкие (0,4 и 0,3 мг/мл) титры PGT121 оказались в плазме двух животных, у которых произошла недельная задержка перед высокой виремией. Эти результаты показали эффективность антител PGT121 против внутриклеточного вируса, но эффективность зависела от их концентрации [4]. При этом способность PGT121 связываться с Fcγ-рецептором была аналогичной у всех животных. Антитела с Fc-зависимой функцией имеют очень важное значение для защиты от ВИЧ-1 и других вирусных инфекций (например, гриппа). Функции антител, связанные с Fc-зависимым механизмом (включая ADCC), очень важны для борьбы с внутриклеточным вирусом, поскольку, в отличие от цитотоксических Т-лимфоцитов, ADCC распознает инфицированные клетки, на поверхности которых выставлены чужеродные белки, кодируемые MHC (от англ. major histocompatibility complex — ‘главный комплекс гистосовместимости’), и рекрутирует иммунные клетки врожденного иммунитета для уничтожения инфицированных клеток и выделения цитокинов.
В 2017 г. у антител (bnAbs и pnnAbs) к гликопротеину Env ВИЧ-1 обнаружены дополнительные функции, которые открывают новые возможности для разработки вакцины: способность вызывать агрегацию вирионов [10]. Нейтрализующие антитела, направленные на основание V3-петли и вершину тримера Env (гликанзависимый эпитоп на gp120), и защитные антитела, нацеленные на объединенные эпитопы на gp41-наружном домене Env, агрегируют вирионы, но в узких диапазонах концентраций. Эти результаты, вместе взятые, открывают новые возможности для разработки эффективной вакцины, индуцирующей антительный ответ.
Усиление иммуногенности шипов ВИЧ
К новым технологиям создания вакцин против ВИЧ относятся новые способы дизайна Env-иммуногенов. Для их создания используются методы структурной биологии, которые помогают преодолеть механизмы ускользания ВИЧ, с чем не могут справиться стандартные подходы по разработке вакцин. Одной из «самых мощных» стратегий создания иммуногенов для ВИЧ-вакцины служит структурно-обоснованный дизайн — многоступенчатый подход, в котором используется современная информация о молекулярных механизмах вирусного ускользания от иммунной системы [11].
Структурно-обоснованный дизайн создает определенную форму и реактивность антигена — единственное свойство, необходимое для индукции иммунного ответа. Для повышения иммуногенности gp120-белка изменяли антигенные свойства у Env-тримера путем формирования иммунных комплексов, в которых моноклональные антитела взаимодействовали с gp120 в месте связывания с рецепторами CD4 (CD4bs). В результате антигенные свойства gp120 менялись, и таким образом удавалось усилить специфический ответ антител против V3-петли белка. Стоит отметить, что нейтрализующая активность антител, выработанных в ответ на конформационные изменения в белке Env, оказалась низкой по отношению к гетерологичным штаммам ВИЧ [12]. Для распознавания антителами MPER (напомню, в этом участке Env находятся консервативные эпитопы, которые вызывают индукцию bnAbs) использовали линейные эпитопы, встроенные в конструкции, ковалентно связанные с липосомами. Полученные анти-MPER-антитела проявляли дополнительную активность по отношению к липидам, что усиливало их эффективность. Кроме того, модификация белков, входящих в комплекс Env, путем удаления вариабельных областей V1-, V2 и/или V3-цепей поверхностной субъединицы gp120 могут регулировать конкуренцию ВИЧ-нейтрализующих антител.
Растворимые рекомбинантные белки способны имитировать нативный Env-тример, или шип на поверхности ВИЧ, состоящий из субъединиц gp120/gp41 с метастабильной структурой. Широко используется метод стабилизации конформации искусственно получаемых растворимых белков gp140 — удаление природного сайта расщепления между gp120 и эктодоменом gp41. Однако конформация очищенного белка gp140 и формируемых им тримеров далека от нативной, а индуцируемые ими антитела чаще всего не вызывают нейтрализации вируса.
Еще один подход, используемый для стабилизации растворимых белков gp140, — обеспечение естественного расщепления gp120-gp41 при введении специфических стабилизирующих мутаций, таких как дисульфидный мостик, который ковалентно связывает две субъединицы. Введение таких мутаций помогало поддерживать эктодомен gp41 в переходной конформации, которая предшествовала процессу слияния, а также предотвращала агрегацию тримеров. С помощью этого способа были получены растворимые Env-тримеры без цитоплазматического домена, напоминающие Env-шипы с закрытой конформацией [13]. Привлекательность этих тримерных поверхностных ВИЧ-1 иммуногенов с закрытой конформацией кроется в их способности выставлять четвертичные эпитопы, которые служат мишенью для bnAbs и в то же время оставляют закрытыми нецелевые эпитопы.
Результаты исследования вакцины RV144 подтвердили важность защиты индуцированных ею антител к V1–V2-области Env ВИЧ-1, имеющих в качестве мишеней ключевые участки на петле V2. В начале текущего года американские ученые получили тримерный JRFL-gp120-иммуноген, введя N-концевой домен тримеризации в область петли V1 белка gp120 с циклически измененным порядком последовательности (cycP-gp120) [14]. Образование связывающих перекрестно-субтиповых антител к gp70-V1V2-структурам у иммунизированных животных показал, что эти антитела возможно нацелены или на консервативный эпитоп в области V1V2, или на определенную конформацию этих структур. Этот иммуноген вызвал у морских свинок нейтрализующую активность антител против различных изолятов ВИЧ-1, обладающих умеренной устойчивостью к действию антител (tier 2). Известно, что принадлежность Env к определенному вирусному субтипу влияет на специфичность индуцированных bnAbs, поэтому доступность эпитопов определенной специфичности (т.е. V1–V2- или СD4-cпецифичных и т.д.) также зависит от штамма Env-тримера ВИЧ-1, выбранного в качестве иммуногена.
Рис. 3. Новая многоступенчатая стратегия модификации Env-тримера для усиления его иммуногенности. Для преодоления резистентности Env-шипов ВИЧ (а) разработана стратегия по их модификации (б–г). Рекомбинантная замена ТМS-домена Env ВИЧ на модифицированный домен Env-белка MMTV и усечение цитоплазматического хвоста (создание короткого СТ) для усиления включения Env тримеров ВИЧ в VLP (б). Вставка α-спиральной последовательности (GCN4) в цитоплазматический домен для стабилизации Env-тримера, ограничивая доступ нецелевых антител и открытию доступа для bnAbs к консервативным эпитопам (в). Модификация гликанового слоя Env-тримера для усиления распознавания нейтрализующими антителами белковых эпитопов (г)
Совместно с американскими коллегами мы разработали принципиально новую стратегию по дизайну иммуногена на основе Env-тримера ВИЧ-1, включенного в вирусоподобные частицы, или VLP [15, 16] (рис. 3). Научная новизна подхода заключается в том, что сконструированы стабилизированные шипы-тримеры Env ВИЧ-1, обладающие уникальными иммунологическими свойствами. Подача сигнала изнутри-наружу на поверхностный домен Env-тримера через модифицированный цитоплазматический домен совстроенной α-спиральной последовательностью позволила значительно изменить функции рецептор-связывающих сегментов в gp120. Это привело к формированию Env-тримера промежуточной формы, возникающей во время конформационной перегруппировки после связывания с CD4, что подтвердило усиление связи антител с корецептором CCR5 [17, 18]. Для этого Env-шип должен был раскрыться, и таким образом у нейтрализующих антител возникала возможность для обнаружения новых консервативных эпитопов. Иммунизация морских свинок вирусоподобными частицами, содержащими такие модифицированные Env-тримеры, вызывала образование нейтрализующих и высокоавидных антител широкого спектра действия, которые эффективно блокировали устойчивые штаммы ВИЧ-1 [15]. Кроме того, эти стабилизированные тримеры образовывали стерические ограничения для эпитопов bNAb. Если иммуноген не имел таких ограничений для сближения с антителами, то возникала высокая вероятность образования «внецелевых» антител. Кроме того, стабилизация Env-тримера приводила к отсутствию продуктов деградации Env-белка в вирусной оболочке (рис. 4).
С еще одним механизмом ВИЧ, позволяющим ему ускользать от иммунного ответа, — низким содержанием Env-тримеров в вирусной оболочке — тоже удалось справиться: были сконструированы VLP с повышенным уровнем Env [19, 20]. Дополнительного включения тримера в VLP добились за счет его модификаций — укорочения цитоплазматического домена на конце gp41 (CT, от англ. cytoplasmic tail — ‘цитоплазматический хвост’); замены домена трансмембранного белка gp41 ВИЧ на домен из гликопротеина Env вируса опухоли молочной железы мышей (MMTV, от англ. mouse mammary tumor virus) с дополнительными модификациями трансмембранного домена (см. рис. 3). Специфические модификации в gp41 в СТ домене (короткий СТ) и в области трансмембранного перекрывающего домена (TMS, от англ. transmembrane spanning domain) влияли на сборку Env-тримеров, значительно увеличивая их содержание в оболочке вирусоподобных частиц и усиливая иммунный ответ у вакцинированных животных (см. рис. 4) [15].
Рис. 4. Конструирование иммуногенных вирусоподобных частиц (VLP). Для создание неинфекционных VLP в качестве платформы для Env-тримеров ВИЧ используются структурные Gag-белки ВИЧ, а усиление иммуногенности VLP достигается за счет включения мембраносвязанных иммуностимулирующих молекул. Слева изображена инфекционная природная вирусная частица с конусообразной белковой сердцевиной (1) с геномной РНК ВИЧ-1 с низким содержанием резистентных к иммунному ответу Env-тримеров с включением продуктов деградации Env и клеточных белков. Справа — высокоиммуногенная неинфекционная вирусоподобная частица с высоким содержанием модифицированных Env-тримеров и иммуностимулирующими молекулами (2)
В сравнении с вакцинами на основе растворимых белков Env вакцины на основе VLP обладают рядом преимуществ. Во-первых, VLP-иммуногены содержат заякоренную в мембрану форму белка Env с цитоплазматическим хвостом, т.е. эпитопы представлены в нативной конформации (отражают эпитопы, присутствующие в вирионе). Во-вторых, Env-тримеры в составе частиц гораздо более эффективны в качестве иммуногенов, чем их растворимые формы. В-третьих, усиление иммуногенности происходит за счет включения дополнительных мембраносвязанных иммуностимулирующих молекул в оболочку VLP. Одними из наиболее эффективных адъювантов для стимулирования Т-клеточного иммунного ответа выступают агонисты TLR (от англ. Toll-like receptor — ‘Toll-подобный рецептор’). Эффективность таких адъювантов может быть улучшена с помощью новых подходов к их дизайну и способам доставки в составе вакцин, например, специально разработанные мембраносвязанные формы. Введение в состав такой вакцины иммуностимулирующих агентов, связанных с мембраной TLR5-лиганда или других агентов, будет существенно усиливать иммуногенность VLP (см. рис. 4), повысит эффективность презентации антигена и/или усилит антительный ответ [21, 22]. Использование Prime-boost (особого режима иммунизации в несколько этапов и разными типами препаратов, первые из которых активируют иммунный ответ, а последующие — усиливают и закрепляют эффект) стимулирует накопление гипермутаций в соматических клетках и образование bnAbs, способных справиться с разнообразием вариантов ВИЧ-1 на мукозных оболочках — входных воротах ВИЧ-инфекции. Кроме того, такие тримеры вызывают образование антител с высокой авидностью или защитных pnnAbs, обеспечивающих дополнительный эффект вакцины против ВИЧ-1. Таким образом, используя стратегию дизайна иммуногена, разработанную с учетом преодоления механизмов ускользания ВИЧ от иммунных ответов, можно создать Env-тримеры, индуцирующие эффективный ВИЧ-специфический иммунный ответ. Мы надеемся, что модификация Env-шипов, использование мембранносвязанных форм адъюватных молекул и специально разработанный режим иммунизации позволят создать эффективную вакцину против ВИЧ.
Литература
1. Parsons M. S., Lloyd S. B., Lee W. S. et al. Partial efficacy of a broadly neutralizing antibody against cell-associated SHIV infection // Sci. Transl. Med. 2017; 9(402): eaaf1483. DOI: 10.1126/scitranslmed.aaf1483.
2. Hessell A. J., Poignard P., Hunter M. et al. Effective, low-titer antibody protection against low-dose repeated mucosal SHIV challenge in macaques // Nat. Med. 2009; 15(8): 951–954. DOI: 10.1038/nm.1974.
3. Robinson H. L. Non-neutralizing antibodies in prevention of HIV infection // Expert. Opin. Biol. Ther. 2013; 13(2): 197–207. DOI: 10.1517/14712598.2012.743527.
4. Взоров А. Н., Урываев Л. В. Критерии для индукции нейтрализующих антител широкого спектра действия против ВИЧ-1 с помощью вакцинации // Молекуляр. биол. 2017; 51(6): 945–957. DOI: 10.7868/S0026898417060076.
5. Manrique A., Adams E., Barouch D. H. et al. The immune space: a concept and template for rationalizing vaccine development // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 2014; 30(11): 1017–1022. DOI: 10.1089/AID.2014.0040.
6. Havenar-Daughton C., Carnathan D. G., Torrents de la Pena A. et al. Direct probing of germinal center responses reveals immunological features and bottlenecks for neutralizing antibody responses to HIV Env trimer // Cell Rep. 2016; 17(9): 2195–2209. DOI: 10.1016/j.celrep.2016.10.085.
7. Haynes B. F., Kelsoe G., Harrison S. C., Kepler T. B. B-cell-lineage immunogen design in vaccine development with HIV-1 as a case study // Nat. Biotechnol. 2012; 30: 423–433. DOI: 10.1038/nbt.2197.
8. Cheeseman H. M., Olejniczak N. J., Rogers P. M. et al. Broadly neutralizing antibodies display potential for prevention of HIV-1 infection of mucosal tissue superior to that of nonneutralizing antibodies // J. Virol. 2017, 91(1): e01762-16. DOI: 10.1128/JVI.01762-16.
9. Mabuka J., Nduati R., Odem-Davis K. et al. HIV-specific antibodies capable of ADCC are common in breastmilk and are associated with reduced risk of transmission in women with high viral loads // PLoS Pathog. 2012; 8(6): e1002739. DOI: 10.1371/journal.ppat.1002739.
10. Alexander M. R., Sanders R. W., Moore J. P., Klasse P. J. Short communication: virion aggregation by neutralizing and nonneutralizing antibodies to the HIV-1 envelope glycoprotein // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 2015; 31(11): 1160–1165. DOI: 10.1089/aid.2015.0050.
11. Kwong P. D. What are the most powerful immunogen design vaccine strategies? A Structural biologist’s perspective // Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2017; 9 (11): a029470. DOI: 10.1101/cshperspect.a029470.
12. Visciano M. L., Tuen M., Gorny M. K., Hioe C. E. In vivo alteration of humoral responses to HIV-1 envelope glycoprotein gp120 by antibodies to the CD4-binding site of gp120 // Virology. 2008; 372(2): 409–420. DOI: 10.1016/j.virol.2007.10.044.
13.. Pugach P., Ozorowski G., Cupo A. et al. A native-like SOSIP.664 trimer based on an HIV-1 subtype B env gene // J. Virol. 2015; 89(6): 3380–3395. DOI: 10.1128/JVI.03473-14.
14. Jones A. T., Chamcha V., Kesavardhana S. et al. A trimeric HIV-1 envelope gp120 immunogen induces potent and broad anti-V1V2 loop antibodies against HIV-1 in rabbits and rhesus macaques // J. Virol. 2018; 92(5): e01796-17. DOI: 10.1128/JVI.01796-17.
15. Vzorov A. N., Wang L., Chen J. et al. Effects of modification of the HIV-1 Env cytoplasmic tail on immunogenicity of VLP vaccines // Virology. 2016; 489: 141–150. DOI: 10.1016/j.virol.2015.09.015.
16. Взоров А. Н., Компанс Р. Вакцины против ВИЧ на основе вирусоподобных частиц и влияние модификаций в белке Env на их антигенные свойства // Молекуляр. биол. 2016; 50(3): 406–415. DOI: 10.7868/S0026898416030113.
17. Vzorov A. N., Compans R. W. Cytoplasmic domain effects on exposure of co-receptor-binding sites of HIV-1 Env // Arch. Virol. 2016; 161(11): 3011–3018. DOI: 10.1007/s00705-016-2998-1.
18. Vzorov A. N., Compans R. W. Effects of stabilization of the gp41 cytoplasmic domain on fusion activity and infectivity of SIVmac239 // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 2011; 27(11): 1213–1222. DOI: 10.1089/AID.2010.0321.
19. Vzorov A. N., Bukrinsky M. I., Grigoriev V. B. et al. Highly immunogenic human immunodeficiency virus-like particles are produced by recombinant vaccinia virus-infected cells // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 1991; 7(1): 29–36. DOI: 10.1089/aid.1991.7.29.
20. Взоров А. Н., Тенцов Ю. Ю., Григорьев В. Б. и др. Образование вирусоподобных частиц белков Gag ВИЧ-1, экспрессируемых рекомбинантным вирусом осповакцины // Молекуляр. биол. 1990; 24(6): 1666–1674.
21. Vassilieva E. V., Wang B. Z., Vzorov A. N. et al. Enhanced mucosal immune responses to HIV virus-like particles containing a membrane-anchored adjuvant // MBio. 2011; 2(1): e00328-10. DOI: 10.1128/mBio.00328-10.
22. Skountzou I., Quan F. S., Gangadhara S. et al. Incorporation of glycosylphosphatidylinositol-anchored granulocyte- macrophage colony-stimulating factor or CD40 ligand enhances immunogenicity of chimeric simian immunodeficiency virus-like particles // J. Virol. 2007; 81(3): 1083–1094. DOI: 10.1128/JVI.01692-06.
* Подробнее см.: Взоров А. Н. Устойчивость ВИЧ и его взаимоотношения с иммунной системой // Природа. 2018. № 10. С. 18–27.
Рис. 1. Активность различных антител против инфекции ВИЧ-1. Антитела, полученные от инфицирванных ВИЧ-1, эффективно блокируют распространение как свободных, так и внутриклеточных вирионов. При экспериментальном заражении модельных животных (приматов и гуманизированных мышей, продуцирующих клетки иммунной системы человека) нейтрализующие антитела широкого спектра действия (bnAbs) эффективно ингибируют ВИЧ-1 и предотвращают заражение (а). Их Fab-область распознает Env-тример вируса и блокирует его проникновение в клетки. Эффективность защитных ненейтрализующих антител (pnnAbs) доказана в клинических испытаниях вакцины RV144 (б). Fc-область этих антител инициирует разрушение вируса или инфицированной клетки с помощью врожденной иммунной системы. Нейтрализующие антитела нового класса (bnAbs+pnnAbs) ингибируют как вне-, так и внутриклеточный вирус (в). Они действуют либо через CD4-связывающий сайт, либо через V3-петлю на gp120, а также вызывают ADCC