Паучий случай

Аркадий Курамшин
«Химия и жизнь» №9, 2017

В эти осенние дни, погнавшись в лесу за неосторожным грибом, мы вполне можем попасть в ловчие сети паука. Конечно, эти сети нас не удержат, мы разрушим ажурное плетение — плод труда арахнида и, стряхивая паутину с лица, рук или одежды, недовольно скажем что-нибудь вроде: «Понавешали тут сетей». Вместе с тем, наверное, стоит удивиться эволюции, создавшей паука и его паутину — прочную и эластичную. Это настолько удачный материал, что уже сейчас его начинают применять люди, и не только в трансплантационной медицине, — из нее даже делают спортивную обувь. Компании, производящие тонны паутины (точнее, белков, входящих в ее состав), растут как грибы.

Самая прочная среди эластичных

Волокна паутины отличаются исключительными механофизическими свойствами. Благодаря прочности на разрыв и упругости они могут поглощать много энергии, не разрушаясь. Если взять одинаковые по массе образцы белка паутины и синтетического арамида — кевларовых волокон, окажется, что кевлар до разрушения сможет поглотить в три раза меньше энергии. В составе фибриллярного белка паучьего шелка основные аминокислотные остатки — глицин, аланин и серин. Прочность и эластичность микрометровых каркасных нитей паутины (то есть радиальных, в отличие от менее прочных спиральных) объясняется тем, что внутри них есть жесткие белковые кристаллы размером в несколько нанометров, соединенные между собой эластичными пептидными связками. Предельное напряжение на разрыв каркасной нити обыкновенного крестовика Araneus diadematus — 1,1–2,7 ГПа. Для сравнения: предел прочности стали 0,4–1,5 ГПа, человеческого волоса — 0,25 ГПа. И обычный шелк уступает паучьему по этому показателю. Конечно, паутину нельзя назвать ни самым прочным, ни самым эластичным материалом, но эти свойства в ней идеально сбалансированы.

Еще 15–20 лет назад в мире существовало не более десяти исследовательских групп, изучавших свойства белков паутины и особенности их образования. Сейчас таких команд уже несколько десятков, а практическое применение паутины в реальной жизни приближают три успешно работающие биотехнологические компании. Исследователи уже раскрыли, как пауки прядут паутину, установили особенности ее состава, и эти детали позволяют находить новые области применения паутины — от регенерации нервной ткани до способов упаковки потребительских товаров и разработки новых клеевых составов. Медиков паучий шелк привлекает не только идеальным сочетанием прочности и эластичности, но и тем, что практически не вызывает иммунного ответа. Белки паутины применяются и в биохимических лабораториях — их цепочки можно модифицировать низкомолекулярными соединениями, придавая белкам особые свойства.

Превращение такого сложного материала, как белки-спидроины, в волокна — нетривиальная задача для химиков и технологов. Фото: AMSilk

Основные компании, ведущие разработки в этой области и уже производящие продукт, — образованные в 2008–2009 годах немецкая AMSilk, японская Spiber и американская (калифорнийская) Bolt Threads. Обычно от появления новой химической компании, создающей принципиально новые химические продукты, до их выхода на рынок и начала продаж проходит намного больше времени.

От косметики до хирургии

Арахнофобы могут не беспокоиться. Предприятия по производству искусственной паутины непохожи на паучьи фермы, там вообще нет пауков и прочих членистоногих. Вместо них «плетением паутины» занимаются трансгенные организмы, которые содержат гены, управляющие экспрессией белков паутины, главным образом бактерии и дрожжевые грибки. Хотя шелк паутины производят и организмы, от которых этого никак не ожидаешь; например, существует стадо генетически модифицированных коз в полсотни голов, которые дают молоко с белками паучьего шелка. Из одного литра молока такой козы можно выделить до 4 граммов этих белков; впрочем, бактерии и грибки оказались более эффективными «эрзац-пауками».

Например, компания AMSilk применяет генно-модифицированные версии E. coli. Бактерий выращивают в больших чанах для ферментации, затем клетки разрушают и выделяют белок паучьего шелка в виде белого порошка, который затем может быть гранулирован, превращен в гидрогель или в волокна, — производители биосинтетической паутины реализуют свою продукцию во всех трех формах.

Уникальные свойства паучьего шелка способствуют его коммерческому применению. В пробирках гидрогели на основе паучьего шелка (слева и в центре), порошок из белков паучьего шелка (справа). Фото: AMSilk

Одно из направлений деятельности AMSilk — косметические средства Silkbeads и Silkgel с белками паучьего шелка, которые обеспечивают коже дышащую защиту от бактерий и вредных веществ в окружающей среде. Биосинтетический паучий шелк часто рекламируют как «веганский шелк» — специально для тех, кто считает неприемлемым убийство окуклившихся гусениц тутового шелкопряда (видимо то, что для получения биосинтетической паутины приходится умерщвлять E. coli, не ввергает веганов в тоску).

Для косметологов биосинтетическая паутина хороша тем, что ее белки не вызывают иммунного ответа и на их поверхности плохо растут и размножаются бактерии. Еще важнее эти свойства для биомедицины, а обусловлены они первичной структурой белков. Волокна шелка паутины состоят из спидроиновых белков, которые содержат повторяющиеся пептидные последовательности, обрамленные неповторяющимися, индивидуальными доменами, более половины аминокислотных остатков в которых приходится на глицин. Возможно, именно высокое содержание глициновых остатков во внешних доменах спидроинов (остальные аминокислотные остатки находятся внутри структуры белков паутины) и делает паучий шелк биосовместимым. Дело в том, что глицин — самая маленькая аминокислота, ее боковая группа, не участвующая в образовании белковой цепочки, состоит из одного атома водорода, и это снижает вероятность участия остатков глицина в химических реакциях и межмолекулярных взаимодействиях. Именно поэтому клетки не могут связываться со спидроинами, и поэтому биотехнологический паучий шелк наносят на поверхность медицинских устройств, чтобы спидроины обеспечивали им биологическую защиту.

Исследователи из AMSilk сообщают об экспериментах, в которых белки паучьего шелка наносили на катетеры из полиуретана, полистирола, полиэтилена, а также на металлы и керамику для имплантатов. Оказалось, что такое покрытие обеспечивает хорошую антибактериальную защиту и снижает риск осложнений при использовании полисилоксановых (силиконовых) имплантатов (Philip H. Zeplin et al. Spider Silk Coatings as a Bioshield to Reduce Periprosthetic Fibrous Capsule Formation // Advanced Funcional Materials, 2014, 24, 2658–2666; doi: 10.1002/adfm.201302813). На покрытии из биотехнологической паутины бактериальные биопленки растут хуже, чем на тефлоне и стали.

Выращивание биологических тканей

Тезка японской компании Spiber — шведская Spiber Technologies еще не может похвастаться продуктами, выведенными на рынок, она находится на стадии опытно-конструкторских разработок и получает белки только в граммовых количествах. Биотехнологи этой компании ввели E. coli лишь часть гена, ответственного за выработку спидроинов, так что бактерии вырабатывают белки размерами около одной десятой от длины нативных белков паучьего шелка. Из этих белков собираются изготавливать сетчатые или пористые каркасы для направленного выращивания стволовых клеток, реконструкции костной ткани и заживления ран. В подобных матрицах уже успешно культивировали клетки млекопитающих. Недавно шведские исследователи модифицировали свои «строительные леса» из шелка, придав им мотив связывания, характерный для гликопротеида фибронектина, и обнаружили, что с таким модифицированным шаблоном клетки кожи связываются эффективнее (Widhe M. et al. A fibronectin mimetic motif improves integrin mediated cell biding to recombinant spider silk matrices // Biomaterials, 2016, 74, 256–266; doi: 10.1016/j.biomaterials.2015.10.013).

Обычно клетки культивируют на плоской поверхности, однако для выращивания большинства органов и тканей необходимы объемные каркасы. Трехмерные пористые системы из укороченных спидроинов с внедренными в них активаторами роста клеток имитируют матрикс ткани и «обманывают» клетки, заставляя их расти в нужном направлении.

Например, исследователи учатся выращивать таким способом небольшие участки ткани поджелудочной железы, необходимые для лечения диабета. Матрицы из паучьего шелка in vitro могут поддерживать стабильность колоний клеток поджелудочной железы человека в течение трех месяцев (Johansson U. et al. Pancreatic Islet Survival and Engraftment Is Promoted by Culture on Functionalized Spider Silk Matrices // PLoS One, 2015, 10, e0130169; doi: 10.1371/journal.pone.0130169). Трехмерная матрица не только обеспечивала жизнеспособность клеток, но и способствовала тому, что они реагировали на стимуляцию глюкозой, вырабатывая инсулин. Со временем ткань увеличивалась в объемах, и в ней формировалось больше сосудов (Shalaly N. D. et al. Silk matrices promote formation of insulin-secreting islet-like clusters // Biomaterials, 2016, 90, 50–61, doi: 10.1016/j.biomaterials.2016.03.006), что повышает шансы на успешную трансплантацию.

Работающая в сотрудничестве со Spiber лаборатория Анны Ризинг из Королевского Каролинского университета Швеции использует модель ex vivo для изучения особенностей регенерации ткани спинного мозга в присутствии паучьего шелка. Исследования показали, что ткань периферического нерва овцы успешно росла на направляющих из паучьего шелка (Widhe M. et al. Invited review current progress and limitations of spider silk for biomedical applications // Biopolymers, 2012, 97, 6, 468–478, doi: 10.1002/bip.21715; Rising A. Controlled assembly: a prerequisite for the use of recombinant spider silk in regenerative medicine? // Acta Biomaterialia, 2014, 10, 4, 1627–1631, doi: 10.1016/j.actbio.2013.09.030).

Подражая природе

Паук прядет паутину с помощью специальных паутинных желез — нити образуются из высококонцентрированного раствора белка, из этого раствора самка паука может свить до семи типов волокон. Недавно в лаборатории Ризинг получили рекомбинантные белки паучьего шелка, которые имеют не только аналогичные натуральным белкам повторяющиеся последовательности, но также N- и С-концы, характерные для паучьего спидроина (Andersson M. et al. Silk Spinning in Silkworms and Spiders // International Journal of Molecular Sciences, 2016, 17, 8, pii: E1290. doi: 10.3390/ijms17081290). В настоящее время N- и С-концы большей части биотехнологических спидроинов не такие, как у природных, а между тем ряд ученых, например Томас Шайбель из Байройтского университета, считают, что именно начало и конец цепи критически важны для образования прочных волокон из водного раствора (Schacht K. et al. Biofabrication of cell-loaded 3D spider silk constructs // Angewandte Chemie Int. Ed., 2015, 54, 2816–2820; doi: 10.1002/anie.201409846).

В настоящее время большинство лабораторных способов, позволяющих превратить белки паучьего шелка в волокна, основаны на применении гексафторизопропанола — токсичного растворителя, который не только опасен, но еще может медленно разрушать белки и имеет высокую себестоимость. Все это исключает возможность его промышленного применения. Недавно был опубликован метод, позволяющий растворять спидроины в чистой воде и получать из них волокно (Jones J. A. et al. More Than Just Fibers: An Aqueous Method for the Production of Innovative Recombinant Spider Silk Protein Materials // Biomacromolecules, 2015, 16, 1418–1425; doi: 10.1021/acs.biomac.5b00226). Раствор для прядения волокон можно сделать с помощью микроволновой печи, предполагается, что растворение обеспечивается воздействием температуры и давления. Компании, разрабатывающие методы прядения волокон из паучьего шелка, придумывают свои подходы, которые не публикуют в открытой печати, но и они предпочитают тянуть искусственную паутину из водного раствора, минимизируя применение дорогих и опасных растворителей.

Лабораторный протокол обработки биотехнологического паучьего шелка предполагает процедуру осаждения-высаливания белков, причем они денатурируют. Затем осажденный и денатурированный белок формируют в волокнистую структуру из суспензии в водно-спиртовом растворе. Отдельные волокна можно свить в нити, содержащие от восьми до двадцати четырех жил, — такие нити уже подходят для практического применения. Но компаниям необязательно прясть паутину — для нанесения покрытий проще использовать биотехнологические спидроины в виде порошка или гидрогеля. Подсчитано, что килограмма паутинных белков хватит на антибактериальные и антикоагулирующие покрытия для нескольких миллионов (от одного до десяти — зависит от размера) катетеров. Есть надежда, что к концу 2017 года такое медицинское оборудование закончат тестировать на животных, в ближайшие 5 лет некоторые его образцы пройдут сертификацию Управления по контролю продуктов питания и лекарственных средств США (FDA) и начнут применяться в клинической практике.

Костюм Спайдермена

Искусственные спидроины применяют не только в биомедицине. Уже упоминалось, что прочность паучьего шелка на разрыв выше, чем у кевлара, но, увы, способность эластично деформироваться в ответ на механическую нагрузку не позволяет рассматривать чистые спидроины в качестве материала для «натуральных» бронежилетов. Пулю бронежилет из паучьего шелка поймает и остановит, но к тому моменту она, скорее всего, выйдет из туловища или застрянет во внутренних органах вместе с «бронежилетом». Преимущество арамидных волокон, из которых делают кевлар, состоит как раз в том, что они не деформируются. Тем не менее композиты спидроинов с арамидами или углеволокном вполне подходят для изготовления гибких и прочных конструкционных элементов автомобилей или беспилотных летательных аппаратов. Существуют композиции рекомбинированного паучьего шелка с керамическими наночастицами, которые могут блокировать газы и пары воды, получаются идеальные материалы для упаковки пищевых продуктов (Doblhofer E. Structural Insights into Water-Based Spider Silk Protein — Nanoclay Composites with Excellent Gas and Water Vapor Barrier Properties // ACS Applied Materials and Interfaces, 2016, 8, 25535–25543; doi: 10.1021/acsami.6b08287). В их производстве не используются токсичные вещества, белки растворяют в воде, а сам композит прозрачен и биоразлагаем.

Еще одно важное преимущество паучьего шелка — он не плавится. Поэтому текстиль из паучьих нитей, натуральных или полученных биотехнологически, интересует создателей армейской экипировки. Под воздействием высоких температур, например вспышек светошумовых и боевых гранат, нейлоновые ремешки каски и других элементов одежды современных солдат могут расплавиться, а то и приплавиться к коже, причинив серьезные ожоги. Волокна и текстильные изделия из искусственной паутины просто обугливаются, что снижает риск дополнительного температурного воздействия на кожу — именно это и интересует военных, готовых платить больше для обеспечения безопасности личного состава. Пока что стоимость биосинтетической паутины высока, и среди одежды доступной ценовой категории вряд ли в ближайшее время можно будет найти вещь с ярлычком «spider silk» (товары с AliExpress не в счет, о них производители могут написать что угодно). Однако две компании все же рискнули вывести на рынок одежду из биотехнологических спидроинов.

Штормовка The North Face из рекомбинированного паучьего шелка. Фото: Uncrate

Так, в сентябре 2015 года компания по производству спортивной одежды для активного отдыха The North Face начала рекламировать и испытывать куртку-штормовку из рекомбинированного паучьего шелка. Первые образцы обещают выпустить уже в этом, 2017 году. Они будут изготовлены из паучьего шелка от японской компании Spiber. Представители компании уверяют, что им удалось снизить затраты на производство спидроиновых волокон до ста долларов за килограмм. Однако чтобы ткани из синтетической паутины перестали быть уделом избранных, себестоимость производства пряжи должна стать хотя бы такой же, как у натурального шелка тутового шелкопряда (30–70 долларов за килограмм, в зависимости от качества). Компания Spiber надеется, что эта цель вполне достижима, ее конкуренты тоже так считают, разрабатывая все более дешевые технологии.

Так, уже упоминавшаяся немецкая компания AMSilk использует белки биосинтетического паучьего шелка для изготовления волокон под торговым названием Biosteel («Биосталь»). Руководство AMSilk уверено, что из этого волокна будут делать обувь и одежду, а также текстиль для отделки кресел автомобилей и самолетов. В 2014 году фирма «Адидас» представила линию спортивной тренировочной обуви, сделанной практически целиком (кроме подошвы) из волокон Biosteel.

Немецкая компания AMSilk производит волокно из синтетического паучьего шелка Biosteel, это волокно использовалось для изготовления тренировочной спортивной обуви

Таким образом, липкая лесная паутинка прошла долгий путь, и теперь из нее плетут прочные сети новые химические компании, которые сумели наладить производство всем известного природного материала и нашли ему множество применений. Может быть, через десять лет производство биосинтетической паутины разовьется настолько, что мы будем спрашивать консультантов в магазине одежды, из какого именно натурального шелка эта кофточка — шелкопрядного или паучьего. Естественно, спидроины шелка будут и дальше оплетать своими сетями хирургию, регенеративную медицину, а также новые области, о которых мы пока и не подозреваем. Глядишь, появится приспособление, способное выстреливать нитью биосинтетической паутины, чтобы лазить по стенам или иммобилизовать недоброжелателей, — и, главное, делать это можно будет, не дожидаясь укуса радиоактивного паука-мутанта.