Эмбрионы и артериальная гипертензия

Сергей Амстиславский, Диана Рагаева,
Евгений Брусенцев, Татьяна Игонина
«Природа» №3, 2015

Об авторах

Сергей Яковлевич Амстиславский — доктор биологических наук, заведующий сектором криоконсервации и репродуктивных технологий Института цитологии и генетики СО РАН. Область научных интересов — сохранение генетических ресурсов животных, механизмы регуляции артериального давления у гипертензивных крыс, влияние репродуктивных технологий на проявление генетически обусловленных свойств потомков.

Диана Сергеевна Рагаева — аспирант того же сектора. Изучает механизмы формирования артериальной гипертензии и отдаленные эффекты длительного культивирования эмбрионов млекопитающих in vitro.

Евгений Юрьевич Брусенцев — аспирант того же сектора. Область научных исследований — адаптация репродуктивных технологий к различным видам млекопитающих, изучение репродуктивных барьеров и способов их преодоления.

Татьяна Николаевна Игонина — кандидат биологических наук, младший научный сотрудник того же сектора. Специализируется на исследовании преимплантационных эмбрионов крыс, предрасположенных к развитию артериальной гипертензии, а также на изучении потомков, родившихся в результате применения вспомогательных репродуктивных технологий.

Вспомогательные репродуктивные технологии (ВРТ) объединяют различные методы преодоления бесплодия, при которых отдельные или все этапы зачатия и раннего развития эмбрионов проходят вне организма матери. Общее число детей, родившихся благодаря бурному развитию этой области медицины за более чем 35 лет со времени первого успешного применения ВРТ, превысило 5 млн. К сожалению, внедрение в практику новых технологий не всегда сопровождается основательными лабораторными исследованиями.

Первоначальный вариант экстракорпорального оплодотворения был направлен главным образом на преодоление женского бесплодия [1]. Вне организма оплодотворяли яйцеклетку (смешением суспензий яйцеклеток и сперматозоидов), а затем вводили полученный эмбрион для дальнейшего развития обратно в репродуктивные пути матери.

Современный же комплекс ВРТ включает в себя также внутриматочную инсеминацию (искусственное введение семени в женские половые пути); инъекцию сперматозоидов, в том числе — отобранных по морфологическим признакам, в цитоплазму яйцеклетки; дозревание ооцитов in vitro; криоконсервацию¹ гамет и преимплантационных (до их внедрения в матку, т. е. до имплантации) эмбрионов; трансплантацию последних и др. Особое место в этом списке занимает культивирование преимплантационных зародышей [2].

Благодаря совершенствованию культуральных сред², в клиниках экстракорпорального оплодотворения все чаще производят трансплантацию зародышей на более поздних стадиях развития.

Культивирование эмбрионов

После того как оплодотворение завершилось и образовалась зигота, зародыши млекопитающих (в том числе и человеческие) начинают дробиться. Первые три цикла деления зиготы человека проходят в яйцеводах на второй и третий день после оплодотворения — в результате зародыш становится восьмиклеточным. Именно на этой стадии эмбрионы человека традиционно и до сих пор пересаживают во многих клиниках. На четвертый день развития происходят важные изменения: завершается еще один цикл деления клеток, они теряют сферическую форму и плотно примыкают друг к другу. Это стадия морулы, по ее достижении зародыш человека, как и большинства других млекопитающих, перемещается в матку. В матке на пятый день развития, пройдя еще один цикл деления, морула превращается в бластоцисту (которая на седьмые сутки беременности внедряется в стенку матки). Сейчас все больше клиник выбирают для трансплантации именно бластоцисты.

Рис. 1. Преимплантационные эмбрионы. Клетки морул (а — крысы линии OXYS, б — человека) компактизированы, они отошли от прозрачной оболочки, которая защищает дробящийся эмбрион, выполняет барьерные функции и обеспечивает обмен веществ с окружающей средой. Бластоцисты (в — крысы линии OXYS, г — человека) содержат бластоцель (заполненную жидкостью полость), внутреннюю клеточную массу (мелкие круглые клетки, из которых разовьются ткани и органы будущего плода) и трофобласт (уплощенные бластомеры, выстилающие изнутри прозрачную оболочку). Все больше клиник выбирает именно бластоцисты для трансплантации эмбрионов человека. Фото авторов (а, в) и Д. В. Никифорова (б, г)

Интересно, что человеческий зародыш по темпам развития очень напоминает мышиный и крысиный (рис. 1). У этих лабораторных грызунов, как и у человека, преимплантационный период проходит весьма динамично. У мышей и крыс миграция зародышей в матку происходит на третьи сутки, а уже на пятый день беременности, пройдя стадию морулы, бластоциста внедряется в стенку матки. У многих других млекопитающих эти процессы занимают больше времени. Например, у кошки зародыш выходит в матку на стадии морулы (рис. 2) лишь на шестой день, а имплантируется на 11-й день беременности. А у горностая эмбрион оказывается в матке на 11-й день после оплодотворения и продолжает свободно там перемещаться еще долгих девять месяцев до имплантации.

Рис. 2. Морула кошки. Фото Т. О. Абрамовой

Как показано в опытах на животных, длительное культивирование эмбрионов in vitro иногда приводит к стойким изменениям фенотипа потомков, рожденных после трансплантации зародышей. В ранних экспериментах А. Макларен и ее коллег мышата, развившиеся из преимплантационных эмбрионов, культивированных со стадии восьми клеток до бластоцисты и затем пересаженных в организм приемной матери (реципиента), весили меньше, чем детеныши, рожденные естественным путем [3]. В этих исследованиях эмбрионы выращивали в синтетической питательной среде, далекой от оптимальной для развития мышиных зародышей, ведь в то время слишком мало было известно об их потребностях во время преимплантационного развития. Многих нужных веществ такая среда не содержала, поэтому рост эмбриона проходил хуже, чем в естественных условиях. Впоследствии удалось добиться того, что потомки, рожденные в результате трансплантации мышиных эмбрионов, которые достаточно длительно культивировались, имели нормальную массу [4].

Другой феномен, получивший широкую известность, — появление крупных новорожденных. Биотехнологи, занимавшиеся трансплантацией выращенных в искусственных условиях эмбрионов овец и крупного рогатого скота, заметили, что рожденные после таких процедур детеныши имели значительно большую массу по сравнению с телятами и ягнятами, появившимися на свет естественным путем [5]. Тогда использовалась полусинтетическая питательная среда с добавлением фетальной сыворотки крупного рогатого скота. Она содержит множество активных веществ, включая различные факторы роста, дозы которых не поддаются измерению. Именно поэтому развившиеся из таких эмбрионов животные имели в некоторых случаях увеличенную массу тела при рождении.

При различии между мышами и овцами в фенотипическом проявлении последствий длительного культивирования, общим для них было то, что менялась экспрессия некоторых ключевых для эмбрионального развития генов. Это связывают с нарушением процессов метилирования ДНК и в результате — с нарушением избирательного инактивирования, «выключения» генов [5, 6]. Так, при культивировании эмбрионов овец в средах, содержащих фетальную сыворотку, уровень метилирования генов, кодирующих рецепторы к инсулиноподобному фактору роста II типа, был сильно снижен, а этим легко объяснить рождение крупных детенышей [6]. В исследованиях на мышах подтвердили, что при культивировании зародышей в искусственных условиях нарушается процесс избирательной инактивации отцовских аллелей некоторых генов. В одних питательных средах эти нарушения были ярко выражены, тогда как в других — фактически отсутствовали [7].

Эффекты культивирования эмбрионов in vitro традиционно воспринимаются как негативные, однако с появлением новых сред, учитывающих потребности зародышей, а главное, после обнаружения положительного воздействия на них факторов роста (подробнее об этом — в последнем разделе) ситуация изменилась. Преимплантационный эмбрион теперь можно подвергнуть влиянию различных веществ, например, дозированным воздействием некоторых ростовых факторов. Вероятно, они могли бы смягчить проявление определенных генетически обусловленных заболеваний. Чтобы понять это, следует вспомнить об эпигенетике. Информация, закодированная в генах, может быть реализована по-разному в зависимости от того, как проходит ранний онтогенез. Следовательно, культивируемый преимплантационный зародыш, будучи наиболее ранним этапом развития млекопитающих, предоставляет уникальные возможности для терапевтического воздействия. Оно может иметь сильные и длительные последствия при формировании фенотипа, когда из этого эмбриона разовьется взрослая особь. Так можно искать способ смягчить или отсрочить проявления генетически обусловленных заболеваний, например, артериальной гипертензии (гипертонии).

Артериальная гипертензия

Гипертонией в развитых странах страдает 20–30% взрослого населения. Чем старше возрастная группа, тем выше распространенность заболевания; в некоторых странах у пожилых людей она достигает 50–60% [8]. Больными гипертонической болезнью считаются люди с длительным и стойким повышением артериального давления, у которых во время систолы оно превышает 140 мм рт. ст., а во время диастолы — 90 мм рт. ст. Уже в 2000 г. в мире было около миллиарда гипертоников, а к 2025 г., по прогнозам, их число превысит 1,5 млрд.

Стресс — важнейший фактор, провоцирующий эссенциальную (первичную) гипертензию у человека. В современном обществе люди часто подвергаются различным видам стресса: эмоциональному, социокультурному и профессиональному. Есть основания полагать, что это приводит к периодам повышения артериального давления, а как следствие — к возникновению гипертонии [9]. Одним из основоположников психосоматического³ направления в медицине — Францем Александером — была выделена группа классических психосоматических заболеваний, куда вошла и артериальная гипертензия. Эта патология часто развивается во время жизненных ситуаций, сопровождающихся тревогой, страхом, беспокойством, растерянностью, скрытым гневом и подавлением агрессии. У гипертоников часто возникает ощущение хронической нехватки времени, для многих из них характерен непрерывный контроль над внешними проявлениями своих чувств.

Ведущая роль в гипертензивных реакциях на стресс признается за симпатической нервной системой, а также ренин-ангиотензиновой. Базовый механизм, с помощью которого организм поднимает артериальное давление, — вазоконстрикция (сужение просвета сосудов), происходящая при усилении тонуса симпатической нервной системы. Вазоконстрикцию обеспечивают альфа-1-адренорецепторы, расположенные на артериолах. К повышению давления имеют отношение как собственно нейроны симпатической нервной системы, выделяющие норадреналин, так и мозговое вещество надпочечников, которое продуцирует еще и адреналин. Оба этих компонента формируют так называемую симпатоадреналовую систему, которая активируется в ситуации острого стресса, требующего (по крайней мере в дикой природе) немедленных физических действий. В таких условиях подъем артериального давления способствует адекватному физическому ответу — борьбе с конкурентами и хищниками, а если противник намного сильнее, то и стремительному отступлению. У склонных к гипертензии людей развивается мощный эмоциональный ответ на ситуацию, воспринимаемую ими как негативную или потенциально опасную, однако физической разрядки, как правило, не происходит. Повторяющиеся ситуации с сужением сосудов без «сброса энергии» со временем могут привести к гипертонии (недаром ее называют «болезнью неотреагированных эмоций»).

Ренин-ангиотензиновая система играет ключевую роль в регуляции артериального давления. Ренин — это протеолитический фермент, образующийся в почках. Его продукция зависит от давления в приносящих артериолах, а также от других факторов, в том числе симпатического тонуса. Под действием ренина ангиотензиноген плазмы крови превращается в ангиотензин I, а тот благодаря ангиотензинпревращающему ферменту — в активное сосудосуживающее вещество ангиотензин II, вызывающее повышение давления. Подавляющее большинство препаратов против гипертензии — это ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента, хотя в последнее время появились и антагонисты рецепторов ангиотензина II. Подтверждение того, что стресс может приводить к возбуждению ренин-ангиотензиновой системы, было получено в опытах над крысами. Их оставляли в клетке, выпуская снаружи голодного кота, который пугал грызунов своим присутствием в течение получаса. После этого у испытуемых крыс повышалось содержание ренина в крови [10]. Интересно, что на человека кошки действуют иначе. У хозяев кошки в ее присутствии в ответ на провоцирующие ситуации существенно меньше поднимается артериальное давление, а затем — быстрее нормализуется [11].

Помимо нейроэндокринных механизмов в подъеме давления и формировании гипертонии участвует и иммунная система. Так, при использовании иммуносупрессантов или у животных с подавленным иммунитетом это заболевание в полной мере не развивается. Считается, что провоцирующие его факторы, такие как стресс, активируют нейронные сети головного мозга, участвующие в повышении тонуса симпатической нервной системы. Это приводит как к усилению вазоконстрикции, так и к активации иммунной системы. Выделяемые Т-лимфоцитами провоспалительные цитокины, в свою очередь, усиливают симпатический сосудистый тонус.

Важнейший маркер хронического стресса — повышенная секреция гормонов коркового слоя надпочечников, глюкокортикоидов. Они обладают разнообразным влиянием на организм, в том числе увеличивают чувствительность адренергических рецепторов кровеносных сосудов к действию норадреналина и адреналина, что может способствовать развитию гипертензии. У человека основной глюкокортикоид — кортизол. Изменение его уровня в условиях психологического стресса выше у тех, кто предрасположен к гипертензии. Кроме того, повышенный уровень кортизола обнаружили у предрасположенных к гипертонии детей, причем еще до того, как она у них возникла. В 30% случаев эссенциальной гипертензии имеет место повышенный уровень кортизола в крови.

Американские кардиологи М. Фридман и Р. Розенман описали связь между склонностью человека к гипертензии и его поведением. Люди типа А, или коронарные личности, чаще подвергаются сердечно-сосудистым заболеваниям (таким как инфаркт миокарда, стенокардия, атеросклероз), чем лица противоположной категории — типа Б. Поведение типа А характеризуется нетерпением; стремлением к доминированию, достижениям и состязанию; склонностью работать на износ; неумением отдыхать. Таким людям присуща повышенная тревожность, а часто и скрытая агрессивность. Гипертоники часто относятся именно к типу А. Однако вопрос, причина ли болезни такое поведение или результат уже сформировавшейся гипертензии, пока остается открытым.

Модели артериальной гипертензии

Поскольку исследования на людях сопряжены с различного рода ограничениями (в том числе этическими), роль стресса и определенных типов поведения в формировании артериальной гипертензии изучают на животных — преимущественно на крысах и реже на мышах. Гипертензивным порогом у лабораторных животных большинством исследователей признается 150 мм рт. ст. [12]. Первая экспериментальная модель артериальной гипертензии была разработана Г. Гольдблаттом с коллегами. Они вызвали ишемию (местное снижение кровоснабжения) почек у собак, наложив на почечные артерии специальные зажимы и оставив их в теле животных после операции. У прооперированных собак артериальное давление существенно поднялось, причем почти у всех оно превысило 200 мм рт. ст. Позже эту же модель успешно применили к кроликам, крысам и даже козам и овцам [13]. Выбор столь крупных млекопитающих, как собаки, козы и овцы, для исследований гипертонии объяснялся тем, что у них можно проще и надежнее померить давление. С развитием соответствующей техники чаще стали использовать крыс. Их легко содержать в современном виварии, и они достаточно велики, чтобы у них можно было легко снять нужные показания. Несмотря на то, что мышей разводить еще проще, мерить у них артериальное давление сложнее в силу их меньшего размера. В 1990–1997 гг. число исследований в области гипертензии, проведенных на крысах, в сотни раз превышало количество работ, выполненных на всех других лабораторных животных, включая мышей [13].

Рис. 3. Измерение артериального давления у крысы линии ISIAH (модель артериальной гипертензии) непрямым методом. Вид сверху на установку. Здесь и далее фото авторов

Существует более десятка хорошо охарактеризованных линий крыс, признанных в мире в качестве генетических моделей артериальной гипертонии [12, 13]. У спонтанно гипертензивных крыс линии SHR (Spontaneously Hypertensive Rat) имеются проявления, сходные с эссенциальной гипертензией человека, это самая известная в мире генетическая модель данного заболевания [13]. В Институте цитологии и генетики СО РАН в Новосибирске профессором А. Л. Маркелем была создана соответствующая отечественная модель. Он еще в 1970-х годах начал выводить новую линию крыс, основываясь на признании роли стресса в развитии гипертонии. В качестве селекционного критерия использовался подъем артериального давления в условиях мягкого эмоционального стресса [14]. Животных на 30 мин помещали в тесные проволочные клетки, как раз соответствующие их размеру. Некоторые из испытуемых реагировали на такое ограничение свободы подъемом давления — они и стали основателями новой гипертензивной линии. Она получила международное признание и известна как ISIAH (Inherited Stress-Induced Arterial Hypertension, или наследственная стресс-индуцированная артериальная гипертензия). Кровяное давление взрослых особей таких крыс при стрессе обычно выше 200 мм рт. ст., при этом в покое оно составляет около 170 мм рт. ст., что тоже существенно превышает порог гипертензии (150 мм рт. ст.). Недавно нашими усилиями крысы линии ISIAH были переведены в SPF-статус⁴. Их физиология и поведение достаточно хорошо изучены [12, 14]. То, что критерием селекции была их гипертензивная реакция на эмоциональный стресс, делает весьма убедительной экстраполяцию экспериментальных результатов, полученных на этой линии, на человека, поскольку и у людей этот фактор — важнейший, если не главный для возникновения эссенциальной гипертензии.

Артериальное давление у крыс измеряют прямым (инвазивным) и непрямым методами. Первый применяют значительно реже, так как канюлирование артерий и непрямой метод дают сходные результаты, а благодаря последнему удается избежать хирургического вмешательства и не причинять животному серьезных неудобств. Классический непрямой метод — сфигмографический (рис. 3), когда на хвост надевают манжету и нагнетают в нее воздух, а специальным датчиком регистрируют пульс в хвостовой артерии. Это очень похоже на известный всем метод измерения артериального давления у человека с помощью тонометра. В своих исследованиях на крысах мы используем именно сфигмографический метод [12].

Поведенческие тесты

Состояние стресса у животных сопровождается специфическим поведением. Для его изучения в лабораторных условиях применяют специальные тесты. Их существует около ста, причем экспериментатор должен сам решить, какие именно выбрать, исходя из целей и задач своего исследования [15]. Мы использовали панель из трех классических поведенческих тестов («открытое поле», «приподнятый крестообразный лабиринт» и «светлую-темную камеру»), позволяющих оценить активность, исследовательскую мотивацию, а также уровень тревожности и эмоциональности крыс.

Рис. 4. Крыса в транспортировочном сосуде (слева) и в тесте «открытое поле» демонстрирует одну из наиболее загадочных и сложно интерпретируемых форм поведения — груминг

В использованной нами модификации теста «открытое поле» проводилась автоматическая регистрация горизонтальной и вертикальной активности крысы. Подсчитывалось количество пересеченных квадратов за все время теста — 6 мин (горизонтальная активность), оценивались число вставаний на задние лапы и суммарное время, проведенное грызуном в этом состоянии (вертикальная). Особое значение также имеет длительность пребывания животного в центре открытого поля. Эти показатели характеризуют общую активность и исследовательскую мотивацию. В тесте «открытое поле» можно наблюдать и другие компоненты поведения, например, груминг⁵ (рис. 4). Его обычно интерпретируют как смещенную активность — один из признаков тревожности. В целом по поведению в этом тесте можно составить представление о том, склонна ли крыса к состояниям тревоги и стресса, насколько она активна, имеется ли у нее выраженная исследовательская мотивация и т. д. Однако более полную картину поведенческого фенотипа грызуна можно получить, сочетая тест «открытое поле» с другими, такими как «крестообразный лабиринт» и «светлая-темная камера».

Рис. 5. Крыса демонстрирует исследовательское поведение в тесте «крестообразный лабиринт»

В тесте «приподнятый крестообразный лабиринт» животное помещают на площадку, от которой под прямыми углами расходятся открытые и закрытые рукава (рис. 5). Регистрируемые показатели — латентный период выхода в открытый рукав, время пребывания и число заходов в закрытые и открытые рукава, а также количество стоек, выглядываний вниз с лабиринта («оценка риска») и актов дефекации. Этот тест позволяет оценить уровень тревожности испытуемых и их общую активность и помогает в интерпретации результатов теста «открытое поле».

Уровень тревожности грызунов дополнительно оценивается в тесте «светлая-темная камера», который основан на их конфликте между врожденным неприятием ярко освещенных участков и спонтанным исследовательским поведением при слабом стрессе (рис. 6). Экспериментальная установка состоит из двух отсеков — темного (закрытого) и светлого (ярко освещенного), между которыми имеется круглое отверстие. Животных сначала на 5 мин помещают в темный отсек, затем на то же время — в светлый. Измеряют длительность нахождения крысы в каждом из отсеков, количество переходов между ними, а также исследовательскую активность.

Рис. 6. Крыса в тесте «светлая-темная камера»

ВРТ и проявление гипертензивного фенотипа

Влияние ранней материнской среды на поведение и физиологию потомков изучают на крысах. Эти исследования можно разделить на две большие группы. Первая использует в качестве основного метода перекрестное воспитание. Потомство крысы-гипертоника передают на воспитание только что родившей самке нормотензивной линии (т. е. с нормальным артериальным давлением, без гипертензии), и наоборот. После обмена пометами начинается процесс приемного вскармливания. Во второй группе исследований изменение материнской среды производят гораздо раньше благодаря методу трансплантации эмбрионов.

Зарубежные коллеги и мы в своих экспериментах доказали, что артериальное давление у генетически предрасположенных к гипертонии крысят, воспитанных приемными матерями нормотензивной линии, существенно ниже, чем у вскормленных биологическими родителями [12, 16]. В то же время детеныши, не предрасположенные к гипертензии, в подавляющем большинстве случаев не заболевают, даже если их воспитывают самки гипертензивных линий.

В опытах по трансплантации эмбрионов крыс гипертензивных линий здоровым грызунам-реципиентам (когда материнская среда кардинально менялась на четвертый или пятый день после зачатия) и наоборот выяснилось, что у крысят, генетически предрасположенных к гипертонии, но пересаженных на стадии преимплантационного зародыша нормотензивной самке, заболевание проявляется в более позднем возрасте и в более мягкой форме, чем у детенышей тех же гипертензивных линий, воспитанных своими биологическими матерями. В обратной ситуации, когда эмбрионы от здоровых крыс пересаживали гипертензивным, эффекты на артериальное давление, как правило, отсутствовали (рис. 7).

Рис. 7. Долгосрочные эффекты на артериальное давление потомков, оказываемые при трансплантации эмбрионов от крыс гипертензивных линий нормотензивным реципиентам (вверху) и наоборот. Красный цвет крысы (и ее эмбрионов) символизирует предрасположенность к гипертензии, белый — ее отсутствие, розовый — развитие заболевания в более мягкой форме

В этих работах эмбрионы в подавляющем большинстве случаев не подвергали длительному культивированию. А значит, эти исследования не полностью соответствуют тому комплексу ВРТ, который применяется в современных клиниках экстракорпорального оплодотворения. В настоящее время доминирует именно длительное культивирование зародышей in vitro перед пересадкой реципиенту — до стадии бластоцисты [2]. Преимущество такой тенденции в том, что, во-первых, эмбрионы, несущие явные генетические аномалии, просто не развиваются (т. е. их выбраковывают), а во-вторых, при трансплантации бластоцист эффективность процедуры, как правило, выше, чем в случае морул. Также эффективность современных ВРТ возросла с созданием сред, в которых основные компоненты находятся в оптимизированных соотношениях, с учетом различных потребностей зародыша на разных этапах преимплантационного развития [17]. Например, ранние эмбрионы (до стадии морулы) используют в качестве энергетического субстрата пируват (пировиноградную кислоту), а при дальнейшем развитии до бластоцисты — глюкозу.

Методы, применяемые в клиниках экстракорпорального оплодотворения, различаются. Поэтому исследований, в которых сравнивают состояние сердечно-сосудистой системы у людей, зачатых естественным путем и рожденных с применением комплекса ВРТ, который включает длительное культивирование in vitro, очень мало. Тем не менее в одном из них, проведенном в Нидерландах, участвовало по 225 человек (до 18 лет) из каждой группы. Артериальное давление у людей, рожденных с применением ВРТ, было достоверно, хотя и несильно повышено [18]. Поскольку гипертензивные состояния усугубляются с возрастом, этот результат — свидетельство того, что проблема взаимосвязи ВРТ и гипертонии актуальна и требует тщательного изучения.

Мы экспериментально моделировали процессы культивирования и трансплантации эмбрионов, осуществляемые в клиниках при обращении в них гипертензивных пациентов. Зародыши на стадии 2–4 бластомеров от крыс-гипертоников линии ISIAH подвергали длительному (в течение 48 ч) культивированию до морул в атмосфере 5% СО₂ при повышенной влажности в специальной среде. Затем их пересаживали самке-реципиенту. Другая группа эмбрионов была получена уже на стадии морулы от крыс ISIAH и не подвергалась культивированию перед трансплантацией. Родившихся в обеих группах детенышей (рис. 8) сравнивали друг с другом и с крысятами, рожденными естественным путем их биологическими матерями.

Рис. 8. Потомство крыс, участвовавших в эксперименте по трансплантации эмбрионов гипертензивных самок. Крысята (с белой шерсткой) развились из эмбрионов ISIAH, трансплантированных самке-реципиенту (с темной окраской меха), у которой артериальное давление в норме

Грызуны, родившиеся в результате прямой трансплантации морул (без культивирования), во время периода вскармливания демонстрировали явные признаки стресса: повышенный уровень груминга в тесте «открытое поле» и отставание в росте. А вот детеныши, родившиеся после пересадки выращенных in vitro эмбрионов, не отличались от контрольных ни по характеристикам роста, ни по поведению. В возрасте двух месяцев у крыс ISIAH всех трех групп (рожденных естественно и после применения двух вариантов ВРТ) измерили артериальное давление в покое. У самцов после прямой трансплантации оно составило в среднем 188 мм рт. ст., что достоверно на 15 мм рт. ст. и более превышало показатели для всех остальных групп. Также у этих самцов снижалась исследовательская активность в тесте «открытое поле». Таким образом, именно те крысята, которые выросли из эмбрионов, подвергавшихся длительному культивированию перед пересадкой, не отличались по своим характеристикам от рожденных естественным путем. А те зародыши, которые не подвергались культивированию, развились в наиболее подверженных стрессу животных, которые во взрослом состоянии отличались ярко выраженными признаками гипертензии и сниженной исследовательской мотивацией.

Такое различие можно весьма просто объяснить. Перед трансплантацией эмбрионы хранят в криобанке (чтобы избежать таких ситуаций, когда есть биоматериал, но нет реципиентов, и наоборот). Зародыши, которые подвергались длительному культивированию, на момент пересадки были уже в активном состоянии развития, так как за двое суток в инкубаторе успели оправиться от шока, связанного с пребыванием в криобанке, и даже пройти два цикла деления. Попав в матку крысы-реципиента, эти эмбрионы продолжили активно развиваться. При рождении они уже были нормально развиты, и стресс во время вскармливания был минимальным. Те же зародыши, которые были трансплантированы сразу же после криоконсервации, попав в матку, какое-то время еще находились в состоянии шока и лишь потом продолжили развитие. Именно в этой группе крысята родились с меньшей массой, отчего испытывали стресс в период вскармливания, а по мере взросления у них наблюдались измененное поведение и усиление признаков гипертензии.

Хотя преимплантационный период развития у крысы и человека почти одинаков по длительности, постимплантационный сильно различается. Общая продолжительность беременности у этого грызуна — около трех недель, а у человека — девять месяцев. Именно короткая беременность крыс позволила нам заметить и изучить отдаленное негативное влияние на развитие потомков такой комбинации ВРТ, как криоконсервация с трансплантацией, а также протективные эффекты добавления в этот комплекс третьего этапа — длительного культивирования эмбрионов в искусственных условиях.

Факторы роста

Культивирование преимплантационных эмбрионов — ключевой этап современных ВРТ, проводимых в клиниках экстракорпорального оплодотворения человека [2]. Несмотря на то, что некоторые вопросы, касающиеся влияния оплодотворения in vitro и последующего выращивания на развитие зародыша, остаются невыясненными, в последние десятилетия достигнут определенный прогресс в понимании этих процессов [17]. Во-первых, стало понятно, что, создавая среды для культивирования эмбрионов, нужно тщательным образом исследовать их природное вместилище — яйцеводы и матку — и попытаться максимально приблизиться к имеющимся там условиям. Во-вторых, каждый физический и химический компонент окружения эмбриона во время его развития in vitro нужно тщательно выверять, варьируя концентрации и предлагая зародышу самому «оценить» эти параметры. В результате многочисленных исследований удалось создать среды, учитывающие видовые особенности эмбрионов (человека, крысы и др.), а также специфические требования к условиям развития в зависимости от его этапа.

Актуальная тема экспериментальной эмбриологии — обогащение культуральных сред факторами роста, которые стимулируют развитие преимплантационных эмбрионов различных видов млекопитающих, включая человека. Ростовые факторы влияют на скорость развития зародышей in vitro до стадии бластоцисты, способствуют клеточной дифференцировке, усиливают потребление глюкозы. Они стимулируют формирование и рост так называемой внутренней клеточной массы в бластоцисте, благоприятствуют ее освобождению от оболочки и имплантации, регулируют процессы апоптоза и даже способствуют увеличению количества рецепторов к самим факторам роста [17].

Из всего многообразия ростовых факторов рассмотрим два. Гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ) — это цитокин широкого спектра действия. Он синтезируется и выделяется эпителиальными клетками репродуктивного тракта самки в ответ на попадание в него во время спаривания активных компонентов семинальной плазмы. Присутствие в культуральной среде этого фактора в определенных концентрациях оказывает стимулирующее действие на преимплантационные эмбрионы мыши и человека [17, 18]. В наших недавних экспериментах с зародышами хомячка Кэмпбелла ГМ-КСФ стимулировали их развитие на стадии дробления, вдвое увеличивая число живых клеток и существенно уменьшая долю фрагментированных (т. е. потерявших жизнеспособность, деградирующих) бластомеров [19]. Эпидермальный фактор роста (ЭФР) — белок, стимулирующий пролиферацию эпителиальных клеток организма. Этот полипептид воздействует на преимплантационные эмбрионы и, как и ГМ-КСФ, стимулирует их развитие у мышей и крыс.

Мы продемонстрировали, что добавление ЭФР улучшает развитие in vitro эмбрионов крыс гипертензивной линии ISIAH (рис. 9). После 72 ч культивирования влияние ростовых факторов было наиболее очевидным. Без их добавления лишь 50% зародышей достигало стадии морулы, а стадии бластоцисты — 14,3% (остальные вообще не развивались). Под воздействием же ЭФР доля эмбрионов, развившихся до бластоцисты, выросла более чем в три раза (56,3%), общее число выживших зародышей достигло 87,5%, а также улучшилось соотношение бластоцист и морул. В еще большей мере добавление в среду этого фактора роста способствовало развитию эмбрионов другой линии крыс — OXYS (модель преждевременного старения).

Рис. 9. Эмбрионы крыс ISIAH, культивирующиеся in vitro,— сразу после извлечения из криобанка (а), через 24 (б), 48 (в) и 72 (г) часа

В силу различных репродуктивных особенностей результаты экспериментов на лабораторных животных сложно переносить на человека. Однако в последнее время в отечественных и зарубежных клиниках экстракорпорального оплодотворения стали активно использовать ГМ-КСФ. Специально разработанная коммерчески доступная среда для культивирования эмбрионов, содержащая этот фактор роста, повышает эффективность применяемых в клиниках процедур: существенно увеличивает долю успешно имплантировавшихся зародышей и снижает число абортов [20].

Отдаленные эффекты факторов роста на проявление гипертензивного фенотипа потомков пока не исследовали ни на людях, ни на лабораторных животных. У нас, однако, есть косвенные основания полагать, что культивирование эмбрионов гипертензивных крыс в присутствии некоторых ростовых факторов может повлиять на проявление заболевания у взрослых особей, в которые эти зародыши разовьются. Мы исследовали влияние ГМ-КСФ и ЭФР, присутствующих в культуральной среде, на поведение крыс, развившихся после трансплантации эмбрионов. Эксперименты проводились на генетических кататониках (страдающих двигательными расстройствами) линии ГК. В основу селекции этой линии был положен принцип «застывания» крысы и сохранения ею позы, приданной экспериментатором. Мы получили эмбрионы таких животных, которые культивировали перед пересадкой с ГМ-КСФ или ЭФР. Интересно, что грызуны линии ГК, рожденные в результате трансплантации зародышей, выращенных в присутствии ЭФР, намного чаще и дольше занимались грумингом, чем те, кто родился естественным путем. В то же время в случае ГМ-КСФ крысы не отличались достоверно по этому поведенческому показателю от контрольных животных. Биологический смысл такого изменения поведения пока трудно объяснить, но важно, что присутствие в среде для культивирования ростового фактора может оказывать влияние на поведение взрослых особей, в которые развиваются эмбрионы.

Наряду с культивированием зародышей в средах с добавлением факторов роста имеется и другой интересный подход к созданию оптимизированных условий для развития ранних эмбрионов — сокультивирование (в одной чашке Петри). Для разных видов млекопитающих доказано, что выращивание эмбрионов в группе (когда они могут свободно обмениваться факторами роста) положительно влияет на их развитие [17]. В наших экспериментах по сокультивированию мышиных преимплантационных зародышей морулы способствовали ускоренному развитию тех эмбрионов, которые еще проходили ранние стадии дробления. Это хорошо согласуется с данными других исследователей. Так, зародыши, находящиеся на более продвинутых этапах преимплантационного развития, значительно стимулируют дробящиеся эмбрионы того же или даже другого вида при совместном культивировании in vitro. Рецепторы к некоторым из факторов роста появляются уже на ранних стадиях развития (например, у человека рецепторы к ЭФР — на первых этапах дробления и даже на стадии зиготы) [17]. Соответственно, такие эмбрионы способны реагировать на факторы роста, выделяемые другими зародышами из группы (особенно если в ней есть эмбрионы более поздних стадий, активно выделяющие в среду ростовые факторы). Поскольку по химической структуре факторы роста млекопитающих сходны, сокультивирование эмбрионов разных видов животных также способно стимулировать развитие зародышей. Так, мышиные эмбрионы, находящиеся на стадии морулы, отчетливо улучшают развитие более ранних кошачьих зародышей [21].

Итак, может ли культивирование эмбрионов крыс ISIAH в присутствии ростовых факторов или совместное культивирование с другими зародышами повлиять на проявление гипертензивного фенотипа у потомков (т. е. на величину их артериального давления и поведение), покажут будущие эксперименты. Гипертония становится все более распространенным заболеванием, поэтому возможность повлиять на ее проявления у детей, которые рождены от пришедших в клинику родителей, генетически предрасположенных к повышенному артериальному давлению, — заманчивая альтернатива применению лекарств. Эксперименты на гипертензивных линиях крыс помогут в поисках таких необычных способов превентивной, а точнее, «преимплантационной» медицины.

Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проект 13-04-00685-a).

Литература:
1. Steptoe P. C., Edwards R. G. Birth after reimplantation of a human embryo // Lancet. 1978. V. 2. P. 366.
2. Hardy K., Wright C., Rice S. et al. Future developments in assisted reproduction in humans // Reproduction. 2002. V. 123. P. 171–183. doi:10.1530/rep.0.1230171
3. Bowman P., McLaren A. Viability and growth of mouse embryos after in vitro culture and fusion // J. Embryol. Exp. Morphol. 1970. V. 23. P. 693–704.
4. Robertson S. A. GM—CSF regulation of embryo development and pregnancy // Cytokine Growth Factor Rev. 2007. V. 18. P. 287–298. doi:10.1016/j.cytogfr.2007.04.008
5. McEvoy T. G., Robinson J. J., Sinclair K. D. Developmental consequences of embryo and cell manipulation in mice and farm animals // Reproduction. 2001. V. 122. P. 507–518. doi:10.1530/rep.0.1220507
6. Young L. E., Fernandes K., McEvoy T. G. et al. Epigenetic change in IGF2R is associated with fetal overgrowth after sheep embryo culture // Nat. Genet. 2001. V. 27. P. 153–154. doi:10.1038/84769
7. Market-Velker B. A., Fernandes A. D., Mann M. R. Side-by-side comparison of five commercial media systems in a mouse model: suboptimal in vitro culture interferes with imprint maintenance // Biol. Reprod. 2010. V. 83. P. 938–950. doi:10.1095/biolreprod.110.085480
8. Cooper R. S., Wolf-Maier K., Luke A. et al. An international comparative study of blood pressure in populations of European vs. African descent // BMC Med. 2005. V. 3. doi:10.1186/1741-7015-3-2
9. Mustacchi P. Stress and hypertension // West J Med. 1990. V. 153. P. 180–185.
10. Clamage D. M., Sanford C. S., Vander A. J. et al. Effects of psychosocial stimuli on plasma renin activity in rats // Am. J. Physiol. 1976. V. 231. P. 1290–1294.
11. Allen K., Blascovich J., Mendes W. B. Cardiovascular reactivity and the presence of pets, friends, and spouses: the truth about cats and dogs // Psychosom. Med. 2002. V. 64. P. 727–739.
12. Рагаева Д. С., Брусенцев Е. Ю., Амстиславский С. Я. Вспомогательные репродуктивные технологии и артериальная гипертензия // Онтогенез. 2014. Т. 45. № 5. С. 299–313.
13. Pinto Y. M., Paul M., Ganten D. Lessons from rat models of hypertension: from Goldblatt to genetic engineering // Cardiovasc. Res. 1998. V. 39. P. 77–88. doi:10.1016/S0008-6363(98)00077-7
14. Markel A. L. Development of a new strain of rats with inherited stress-induced arterial hypertension // Genetic hypertension. London. 1992. P. 405–407.
15. Hanell A., Marklund N. Structured evaluation of rodent behavioral tests used in drug discovery research // Front. Behav. Neurosci. 2014. V. 8. P. 1–13. doi:10.3389/fnbeh.2014.00252
16. Амстиславский С. Я., Попова Н. К., Томилова Ю. Э. и др. Влияние материнской среды на артериальное давление и рефлекс испуга у крыс с наследственной артериальной гипертензией // Российский физиологический журнал им. И. М. Сеченова. 1998. Т. 84. № 8. С. 783–790.
17. Брусенцев Е. Ю., Игонина Т. Н., Амстиславский С. Я. Традиционные и современные подходы к культивированию преимплантационных эмбрионов млекопитающих in vitro // Онтогенез. 2014. T. 45. № 2. С. 73–88.
18. Ceelen M., van Weissenbruch M. M., Vermeiden J. P. et al. Cardiometabolic differences in children born after in vitro fertilization: follow-up study // J. Clin. Endocrinol. Metab. 2008. V. 93. P. 1682–1688. doi:10.1210/jc.2007-2432
19. Amstislavsky S., Brusentsev E., Kizilova E. et al. Embryo cryopreservation and in vitro culture of preimplantation embryos in Campbell’s hamster (Phodopus campbelli) // Theriogenology. 2014. doi:10.1016/j.theriogenology.2014.12.013
20. Tevkin S., Lokshin V., Shishimorova M. et al. The frequency of clinical pregnancy and implantation rate after cultivation of embryos in a medium with granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) in patients with preceding failed attempts of ART // Gynecol. Endocrinol. 2014. V. 30. P. 9–12. doi:10.3109/09513590.2014.945767
21. Spindler R. E., Crichton E. G., Agca Y. et al. Improved felid embryo development by group culture is maintained with heterospecific companions // Theriogenology. 2006. V. 66. P. 82–92. doi:10.1016/j.theriogenology.2006.03.021

¹ Подробнее см.: Амстиславский С. Я., Абрамова Т. О., Брусенцев Е. Ю., Кизилова Е. А. Криоконсервация и сохранение биоразнообразия // Природа. 2014. № 9. С. 24–33.

² Культуральная среда — питательный материал в твердой или жидкой форме, который используют для выращивания клеток микроорганизмов, растений или животных in vitro.

³ Психосоматика (от греч. ψνχη — душа и σωμα — тело)— раздел медицинской психологии, занимающийся изучением роли психических факторов в развитии функциональных и органических расстройств.

⁴ Статус SPF (Specific Pathogen Free, или свободный от специфичных патогенов) означает, что лабораторные животные избавлены от основных патогенов, которые могут влиять на результаты экспериментов. Изложенные в этой статье результаты получены именно на таких крысах.

⁵ Груминг — активное поведение животных, направленное на очищение тела.