Правая, левая где сторона?

А. С. Ермаков,
кандидат биологических наук
«Химия и жизнь» №8, 2014

Посвящается памяти моего друга и коллеги Джонатана Стивенса (1979–2013), замечательного человека и ученого, так мало прожившего, но так много успевшего сделать.

Симметрия и асимметрия нашего тела

В животном мире существуют разные формы симметрии (рис. 1). Есть группы животных со сферический симметрией (например, вольвокс), радиальной (гидроидные полипы или морские звезды), хиральной (брюхоногие моллюски), билатеральной, или двусторонней, симметрией (ею обладают многие группы животных, например плоские и кольчатые черви).

Рис. 1. Вольвокс (1) — колония жгутиковых одноклеточных водорослей — обладает сферической симметрией. У морской звезды (2) — необычная для царства животных лучевая симметрия. Большинство подвижных организмов имеют двустороннюю симметрию (3 — планария), но особняком среди них стоят брюхоногие моллюски (4), часть тела которых закручена спиралью

С точки зрения биологической систематики человек относится к царству животных и принадлежит к отряду приматов класса млекопитающих типа хордовых. У людей по две руки и две ноги, два глаза, два уха... — и все наши парные органы представляют собой как бы зеркальное отражение друг друга относительно средней линии. Это говорит о том, что человек, как и прочие млекопитающие, обладает двусторонней симметрией. Однако если рассмотреть наше внутреннее строение, то выяснится, что мы асимметричны — сердце у нас с левой стороны (что свидетельствует об асимметрии сердечно-сосудистой системы), асимметрична пищеварительная система — желудок у нас слева, а печень справа. Асимметрично устроена и дыхательная система: легкие человека имеют три доли с правой стороны и две доли с левой.

Позвоночные животные, включая млекопитающих и человека, имеют три оси тела — передне-заднюю, дорзо-вентральную (спинно-брюшную, если перевести с латинского на русский) и лево-правую (рис. 2).

Рис. 2. Оси и плоскости симметрии тела человека

В ходе индивидуального развития эмбриона первой закладывается передне-задняя ось (выделяются головной и хвостовой концы туловища), затем — дорзо-вентральная. Лево-правая ось тела закладывается самой последней. О том, как это происходит, мы и расскажем.

Термин «лево-правая висцеральная асимметрия» относится именно к асимметричному строению внутренних органов. Не следует путать висцеральную асимметрию с функциональной и поведенческой, это разные явления. Например, лево- и праворукость с положением внутренних органов никак не связаны, по крайней мере, до настоящего момента четких доказательств такой связи не найдено. Сердце обычно находится слева и у левшей, и у правшей. А у кого оно справа — об этом пойдет речь дальше.

Биение ресничек

Помимо чисто фундаментального научного интереса, изучение установления лево-правой асимметрии у млекопитающих имеет и важное прикладное значение — ведь среди людей встречаются представители с аномалиями установления лево-правой асимметрии органов, примерно у одного на 8000. У одного новорожденного из 20 000 наблюдается situs inversus — аномалия, при которой происходит полная инверсия внутренних органов относительно сагиттальной плоскости. Поскольку инверсия в данном случае абсолютная, работа органов скоординирована, и урона здоровью аномалия не наносит. Скорее всего, оценка встречаемости situs inversus у человека занижена, так как не все носители инверсии попадают в поле зрения медиков. Наблюдаются и другие типы аномалий, такие, как изомеризм (потеря асимметрии), инверсия отдельных органов и гетеротаксия (потеря согласованности органов), которые могут привести к серьезным осложнениям здоровья.

В 70-е годы шведский ученый Бьорн Афзелиус из Института Веннера-Грена в Стокгольме изучал пациентов с синдромом Картагенера — наследственным заболеванием, при котором наблюдается инвертирование внутренних органов, и обнаружил, что жгутики сперматозоидов у них теряют подвижность. У этих людей также не работали реснички в дыхательных путях, из-за чего они страдали синуситами и другими респираторными заболеваниями. Афзелиус внимательно изучил сперму четырех пациентов под электронным микроскопом и обратил внимание на аномальное строение микротрубочек — именно эти внутриклеточные образования отвечают за биение ресничек и жгутиков. В микротрубочках больных отсутствовали динеиновые ручки — структуры, построенные из белка динеина: они участвуют в движении микротрубочек и соответственно необходимы для биения жгутиков и ресничек (рис. 3).

Рис. 3. Вверху — динеиновые ручки видны на электронных фотографиях ресничек жгутиков сперматозоидов здоровых мужчин (A), но отсутствуют у пациентов с синдромом Картагенера (B); справа схематическое изображение реснички (C) (Afzelius B.A., Science, 1976, 193, 4250, 317–319). Внизу — строение поперечного среза жгутика или реснички эукариот, каким оно представляется сегодня. О том, какие молекулярные механизмы заставляют жгутик изгибаться, всё еще идут споры, но динеиновые ручки для этого точно необходимы (по: Journal of Cell Science, 2010, 123, 519–528)

К тому времени уже было известно, что реснички присутствуют в клетках эмбрионов некоторых животных и, в частности, в клетках гензеновского узелка эмбрионов млекопитающих. Гензеновский узелок — зародышевый орган, играющий важную роль в организации оси тела будущего организма: впадина, которую образуют клетки, покрытые ресничками. Сопоставив факты, Афзелиус предположил, что реснички каким-то образом могут влиять на установление лево-правой асимметрии в эмбриональном развитии.

«Зеркальные» мыши-мутанты

Проводить генетические и эмбриологические эксперименты на людях и человеческих эмбрионах нельзя по этическим причинам. С другой стороны, развитие биологической и медицинской науки невозможно без экспериментальных исследований. Данный парадокс, однако, разрешается тем, что многие явления в общих чертах схожи у самых разных живых организмов, так что, проведя эксперименты на представителях одного вида, можно сделать выводы о механизмах биологических процессов для больших групп. Особенности наследования биологической информации были изучены в экспериментах на растениях, дрозофиле, вирусах и микробах, однако открытые принципы оказались универсальными — справедливыми почти для всех живых существ.

Установление лево-правой висцеральной асимметрии наблюдается у всех млекопитающих, и, начиная с 1990-х годов, этот процесс активно изучают на мышах. Они неприхотливы и быстро размножаются, эксперименты на этих животных этически приемлемы. В ходе эмбрионального развития мыши лево-правая асимметрия устанавливается примерно через восемь с четвертью дней. Этот процесс осуществляется в два этапа. На стадии семи с половиной дней происходит потеря симметрии и возникает лево-правая асимметрия (этап 1 — потеря симметрии), а затем включается каскад генов с асимметричной экспрессией, в итоге начинают работу гены, ответственные за морфологические перестройки, и образуются специфические морфологические структуры (этап 2 — реализация асимметрии).

Уже в 1990-е годы было установлено, что основной регулирующий фактор этапа 2 у млекопитающих — экспрессия гена Nodal, продукт которого, в свою очередь, запускает экспрессию гена Ptx2 в левой части эмбриона. Именно эти гены определяют, разовьются ли в левой части эмбриона морфологические признаки левой стороны тела, поэтому сигнальный каскад Nodal-Ptx2 называют также каскадом латеральности («левостороннести»). Однако непонятно было, что происходит на самом раннем этапе установления асимметрии у млекопитающих.

На стадии восьми с четвертью дней развития у зародыша мыши хорошо обозначена передняя часть с головой и зачатком сердца, далее идут средняя часть с оформившейся хордой и задняя часть, заканчивающаяся гензеновским узелком (рис. 4). По сторонам от средней линии тела, вдоль которой протянулась хорда, располагаются сомиты (из них разовьются потом мышцы, кости и глубокий слой кожи), затем идут боковые пластинки, из которых развиваются некоторые парные внутренние органы, например почки.

Рис. 4. Зародыш мыши на стадии 8,25 дня, вид слева: передняя часть — А, задняя — Р, буквой L отмечена левая боковая пластинка. Внизу виден гензеновский узелок (node). Изображение получено методом сканирующей электронной микроскопии (Hamada et al., Nature Review Genetics, 2002, 3, 2, 103–113)

В 1990-х годах американские исследователи из группы Мартины Брюкнер (Йельский университет, штат Коннектикут, США) открыли, что мутация iv в гене одного из динеинов, лево-правого, — left/right-dynein, или lrd, — может приводить к инвертированному положению внутренних органов у мышей (Nature, 1997, 389, 6654, 963–966). Поскольку лево-правый динеин входит в состав микротрубочек, это открытие стало дополнительным аргументом в пользу гипотезы Афзелиуса.

Клетки в нижней части гензеновского узелка покрыты ресничками, направленными от поверхности эмбриона (рис. 5). Сначала считалось, что эти реснички неподвижны, но потом исследователи из Токийского университета показали, что они бьются с частотой примерно 600 раз в минуту (Nonaka et al., «Cell», 1998, 95, 6, 829–837). Кроме того, авторы методами генной инженерии создали линию мышей с нарушением работы гена KIF3B и изучили особенности биения ресничек у таких животных. Белок — продукт этого гена — необходим для работы ресничек, у эмбрионов мышей с нарушенной работой KIF3B, в отличие от эмбрионов дикого типа, реснички не изгибаются.

Рис. 5. Гензеновский узелок эмбриона мыши с увеличением 600 (вверху) и 6000. А и Р — передняя и задние части эмбриона, L и R — левая и правая половины тела. Стрелкой на нижней фотографии отмечена ресничка

Японские ученые культивировали зародыши в среде с микроскопическими флюоресцентными частицами, ведя микросъемку перемещения этих частиц. Таким образом они смогли заметить, что биение ресничек создает над гензеновским узелком эмбрионов дикого типа ток жидкости, направленный справа налево. У эмбрионов мышей с нарушенной работой KIF3B перемещения жидкости не наблюдалось.

Поскольку «узелок» по-английски node, такой ток жидкости получил название nodal flow — «ток в гензеновском узелке». Авторы предположили, что именно это явление — причина потери билатеральной симметрии при развитии зародыша.

Ток жидкости включает асимметрию

Это предположение получило блестящее подтверждение в работах японских ученых Сигенори Нонаки и Хидетака Сиратори из лаборатории Хироси Хамады в Университете Осаки (Nature, 2002, 418, 6893, 96–99, DOI: 10.1038/nature00849). Гипотезу о роли тока жидкости на этапе потери билатеральной симметрии они проверили с помощью прямого физического воздействия. Исследователи создали специальную камеру для культивирования мышиных эмбрионов, в которой можно было искусственно менять направление и скорость циркуляции жидкости и таким образом воздействовать ее потоками на гензеновский узелок.

В опытах участвовали генно-модифицированные мыши линии Ptx2-lacZ — у эмбрионов таких мышей легко прослеживать экспрессию гена Ptx2, который в норме экспрессируется в левой стороне тела и играет важную роль в идентификации данной стороны как левой. Эмбрионы на стадии 7,7–8,5 дней развития в течение 12 часов подвергали одному из четырех режимов: левосторонний медленный ток жидкости, левосторонний быстрый, правосторонний медленный и правосторонний быстрый (рис. 6). Затем ученые выращивали эмбрионы и оценивали их морфологическое строение, а также особенности экспрессии гена Ptx2.

Рис. 6. Схема устройства для изучения воздействия тока жидкости на развитие эмбрионов мыши: а — в камере, где культивируются эмбрионы, насос создает ток культуральной жидкости с заданными параметрами; б — левосторонний ток жидкости (красная стрелка) направлен так же, как и естественный, созданный биением ресничек в гензеновском узелке (зеленая стрелка); в — правосторонний ток жидкости противоположен естественному левостороннему току

При быстром левостороннем токе у эмбрионов развивалась нормальная лево-правая висцеральная асимметрия (правосторонняя сердечная петля, нормально ориентированный поворот эмбриона, экспрессия Ptx2 в левой латеральной пластинке). Быстрый правосторонний ток, напротив, у большинства эмбрионов вызвал инвертированное формирование сердечной петли, Ptx2 экспрессировался в правой латеральной пластинке. При медленном токе, как левостороннем, так и правостороннем, наблюдались лишь незначительные аномалии лево-правой асимметрии.

Таким образом, японские эмбриологи получили прямые доказательства того, что именно направление тока жидкости в гензеновском узелке формирует отличия правой стороны тела млекопитающего от левой.

Молекулы или механика?

Роль биения ресничек в этом процессе сегодня признает большинство эмбриологов. Однако до сих пор нет единого мнения о том, каким образом сигнал о токе жидкости в гензеновском узелке передается в ткани эмбриона, как запускается каскад латеральности в левой половине тела. На этот счет существуют две гипотезы (рис. 7).

Рис. 7. Что запускает формирование лево-правой асимметрии в организме млекопитающих? Вверху схематически изображена гипотеза переноса морфогена (ток жидкости переносит к левой стороне эмбриона сигнальное вещество), внизу — биомеханическая гипотеза (ток жидкости колеблет особые реснички, которые служат антеннами, принимающими сигнал). По: Ермаков, «Онтогенез», 2013, 44(5), 1–16

Гипотеза переноса морфогена была высказана первой, еще в 1990-х. Те же японские ученые, которые продемонстрировали биение ресничек гензеновского узелка, предположили, что, благодаря левостороннему току жидкости в левой части узелка, увеличивается концентрация сигнальной молекулы, которая и запускает экспрессию гена Nodal и сигнальный каскад латеральности Nodal-Ptx2 (Nonaka, 1998).

Альтернативную «гипотезу двух типов ресничек», или биомеханическую гипотезу, выдвинули в начале 2000-х американские ученые под руководством Мартины Брюкнер. Они предположили, что реснички гензеновского узелка работают не только как генераторы механического сигнала, но и как его рецепторы — одни создают ток, другие колеблются под его воздействием (Cell, 2003, 114, 1, 61–73, DOI: 10.1016/S0092-8674(03)00511-7). Авторы статьи открыли, что существует две группы ресничек: подвижные, расположенные в средней части гензеновского узелка, которые содержат лево-правый динеин, — и расположенные по периферии, без лево-правого динеина и неподвижные. Подвижные реснички создают ток жидкости, а неподвижные работают как механосенсоры благодаря содержанию в них механочувствительного белка — продукта гена Pkd2. В ответ на ток жидкости открываются кальциевые ионные каналы в клетках левой части эмбриона, концентрация внутриклеточного кальция растет, что, в свою очередь, запускает важные сигнальные процессы, приводящие к активации экспрессии ряда генов и, в частности, к запуску сигнального каскада латеральности.

В 2012 году появился серьезный аргумент в пользу биомеханической гипотезы. С помощью тонких экспериментов в лаборатории Хироси Хамады (Science, 2012, 338, 6104, 226–231, DOI: 10.1126/science.1222538) показали, что продукт гена Pkd2 действительно активирует запуск каскада латеральности в краевых клетках гензеновского узелка. Исследователи создали несколько линий мышей, у которых ген Pkd2 можно включить или в центральной части, или в краевых клетках гензеновского узелка. Зародышей таких мышей подвергали действию левостороннего тока жидкости. Выяснилось, что для запуска каскада латеральности необходима работа гена Pkd2, кодирующего механорецептор, именно в краевой части гензеновского узелка, но не в центральной. Этот процесс нарушался, если на зародыши воздействовали веществами, изменяющими концентрацию ионов кальция в клетках. Таким образом, основные положения «модели двух типов ресничек», высказанные группой Мартины Брюкнер, — сенсорная роль ресничек в краевой области гензеновского узелка и участие в механизме потери симметрии Pkd2 и кальциевой сигнализации — блестяще подтвердились!

Еще одним сильным аргументом в пользу биомеханической гипотезы стало другое открытие этой же группы исследователей. Оказалось, что для установления лево-правой асимметрии достаточно, чтобы билось всего две реснички (Nature Communications, 2012, 3, 622, 1–8, DOI: 10.1038/ncomms1624), а для приема сигнала достаточно лишь нескольких ресничек-реципиентов. Проведя тщательный скрининг мутантных линий мышей, ученые выяснили, что у некоторых эмбрионов бьются всего две реснички в области гензеновского узелка, но тем не менее каскад латеральности у них запущен. Это хотя и не прямой, но все же важный аргумент, так как теоретические расчеты показывают, что для создания градиента сигнальных молекул необходим более сильный ток, чем тот, что порождают две реснички.

Чего мы еще не знаем

Насколько консервативен этот механизм, то есть насколько он распространен в природе? До середины 2000-х большинство исследователей считало, что биение ресничек и создание левостороннего тока жидкости как механизм инициации лево-правой асимметрии уникальны для млекопитающих. В 2005 году вышла работа Джеффри Эсснера и его коллег из университета Юты (Development, 2005, 132, 6, 1247–1260, DOI: 10.1242/dev.01663), которые показали, что в купферовом пузырьке рыбки данио, так же, как в гензеновском узелке млекопитающих, происходит биение ресничек и что реснички эти необходимы для нормального установления лево-правой асимметрии.

Роль биения ресничек в раннем развитии земноводных была открыта еще через несколько лет на зародышах шпорцевой лягушки Xenopus laevis. Этот феномен не так просто наблюдать у земноводных: у них бьются реснички клеток крыши первичной кишки, спрятанной, естественно, внутри эмбриона. Крышу первичной кишки образуют ввернувшиеся клетки шпемановского организатора амфибий — зародышевой структуры, гомологичной гензеновскому узелку млекопитающих. Открытие биения ресничек и левостороннего тока не только у млекопитающих, но и у рыб и амфибий позволяет выдвинуть гипотезу о том, что такой механизм слома симметрии возник у позвоночных давно и довольно широко распространен (Blum et al., Developmental Dymanics, 2009, 238, 1215–1225).

Понятно, что это далеко не конец истории: в нашем представлении о механизме установления лево-правой симметрии у млекопитающих остаются пробелы. Высказываются аргументы и в пользу той точки зрения, что существует каскад контроля над установлением левостороннего морфогенеза, независимый от Nodal. В одной из работ группы Доминика Норриса из Исследовательского центра в Харвелле, что близ Оксфорда, было показано, что в мезодерме левой, но не правой латеральной пластинки экспрессируется ген Ablim1, как в присутствии, так и в отсутствие экспрессии гена Nodal. Это значит, что есть по крайней мере один ген с асимметричной экспрессией, независимый от сигнального каскада латеральности Nodal-Ptx2. Открытие сделал мой друг и коллега по работе в Харвелле Джонатан Стивенс (Stevens et al., BMC Developmental Biology, 2010, 10, 54, 1–12, DOI: 10.1186/1471-213X-10-54). К сожалению, в канун 2014 года Джонатана не стало из-за тяжелой болезни — паркинсонизма. Светлая память этому замечательному человеку!

Очевидно, для более полного понимания механизмов установления лево-правой асимметрии у млекопитающих необходимо объединить усилия ученых разных направлений — не только эмбриологов и генетиков, но и биофизиков, математиков, механиков, реологов, структурных биохимиков, кристаллографов и специалистов по компьютерному моделированию. Изучение этого типа морфогенеза — замечательный пример того, насколько тесно генетика и молекулярная биология могут смыкаться с биомеханикой и биофизикой.