Адаптация к бездне

Д. А. Афонников, К. В. Гунбин, В. В. Суслов,
Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирский государственный университет
«Химия и жизнь» №3, 2010

Эволюция глубоководных архей

Жизнь на грани возможного

Удивителен мир прокариот-экстремофилов. Они встречаются в соленых озерах, гейзерах, сухих пустынях, льдах Антарктики, в глубинах океана, нефтяных резервуарах и в стратосфере, то есть там, где, казалось бы, жизнь невозможна. А ведь нередко они там не просто попадаются, но и активно живут, и размножаются. Условия обитания в этих местах, по мнению геологов и астрономов, во многом напоминают раннюю Землю или другие планеты Солнечной системы и дальнего космоса. Изучение микроорганизмов на пределе их жизнестойкости помогает реконструировать возникновение жизни в условиях древней Земли и механизмы, с помощью которых эта жизнь колонизировала новые биотопы, возникающие по мере остывания первобытной планеты.

Эти исследования представляют не только академический интерес. В 1983 году биохимик Кари Маллис создал технологию полимеразной цепной реакции — ПЦР, без которой трудно представить современную молекулярную биологию. У него ничего бы не получилось без фермента Taq-полимеразы, выделенной из бактерии Thermus aquaticus — эту бактерию микробиолог Т. Брок обнаружил в гидротермах Йеллоустоунского национального парка. Taq-полимераза стала «молекулой года» (отметим, что первым ее описал наш соотечественник А. Каледин в 1980 году), К. Маллис — нобелевским лауреатом 1993 года, а весь мир понял, что микроорганизмы-экстремофилы — сокровищница ферментов для биотехнологии.

В конце 1970-х годов было сделано выдающееся открытие: стало известно о существовании «черных курильщиков» — принципиально новых экосистем в глубинах океана, использующих вместо фотосинтеза реакции окисления неорганических веществ. Обычно на глубинах от нескольких сотен метров до 10 километров царит мрак, температура держится в пределах нескольких градусов Цельсия, а гидростатическое давление может достигать тысяч атмосфер. Отсутствие фотосинтеза и медленная конвекция вод превращают их в темную холодную пустыню, жизнь в которой зависит от поступления органики и кислорода сверху. Резко отличаются от них зоны вблизи океанических хребтов. Здесь работает своеобразная тепловая машина: холодная морская вода под давлением 300–500 атм проникает через систему трещин к породам, разогретым до 300–400°C, превращается здесь в перегретый флюид с повышенной кислотностью (рН = 2–3), насыщенный сероводородом и сульфидами металлов, и вновь выбрасывается в океан. Возникают «черные курильщики» — гидротермальные источники с большой концентрацией пирита (дисульфида железа), который, осаждаясь, образует в толще воды клубы черной взвеси, а на дне — причудливые «башни» высотой в несколько десятков метров. Но несмотря на экстремальные условия, здесь процветает необычная экосистема, чья основа — прокариоты-хемосинтетики, восстанавливающие серу и окисляющие водород с выделением метана и сероводорода. Это виды-пьезофилы, устойчивые к высоким давлениям. Большинство из них также термофилы (оптимальная температура роста 60–80°C) и даже гипертермофилы (оптимальная температура роста выше 80°C).

Каким же образом эти организмы приобрели в ходе эволюции столь необычные свойства? Был ли процесс приспособления похож на случайное блуждание в поисках благоприятных мутаций или двигался более «рациональным» путем, затрагивая прежде всего определенные физиологические системы клеток? Ученые надеются, что найти ответ на эти вопросы помогут геномные данные, которые в последнее время накапливаются в огромном количестве. Далее мы расскажем о мутациях в геномах архей и о том, следует ли считать их случайными или направленными на приспособление к определенным условиям обитания. (Подробнее эти результаты изложены в статье Гунбина и соавторов, см. ссылку в конце текста.)

Пирококки — археи-экстремофилы

Архей рода пирококки (Pyrococcus) обитают в гидротермах океана, в том числе и рядом с черными курильщиками. Для геномов трех из них, P. furiosus, P. horikoshii и P. abyssi, уже известны полные последовательности нуклеотидов, и теперь данные об их генах интересно сопоставить с условиями, в которых эти организмы обитают. Наилучшие для роста значения температуры, солености и кислотности среды похожи для всех трех видов. Вообще они могут размножаться и при давлениях, близких к атмосферному, но предпочитают жить на разной глубине. P. furiosus может существовать при давлениях не выше 20 МПа (0,1 МПа примерно равен 1 атм.) в мелководных горячих источниках. P. horikoshii обитает на глубинах около 1400 м (около 14 МПа), однако может выдержать до 40 МПа. P. abyssi встречается около 2000 м (около 20 МПа) и выживает до 50 МПа. Из других экологических особенностей отметим, что P. furiosus утратил гены хемотаксиса (не может двигаться в сторону нужных ему веществ), а Р. horikoshii — гены синтеза некоторых аминокислот, и теперь гибнет на субстратах, бедных аминокислотами и пептидами.

Чтобы установить обстоятельства происхождения трех видов, мы сопоставили последовательности генов их 16S РНК (одной из РНК, входящих в состав рибосом) с генами некоторых других пирококков. Оказалось, что микроорганизмы, живущие на глубинах около 2200 м, наиболее близки к их общему предку. Скорее всего, на таком уровне он и обитал когда-то, а потом начали образовываться и отделяться от общего ствола новые виды (рис. 1). Анализ генов 16S РНК показал, что сначала это проделали предки P. furiosus. Они ушли в поверхностные воды, потеряв при этом часть функций, необходимых для выживания в глубинах. Затем разделились P. horikoshii и P. abyssi. Предки первого поднялись до 1400 м, разучились жить при повышенном давлении, освоили области, богатые аминокислотами, и перестали синтезировать некоторые из них. Второй вид, вероятно, ближе всего к общему предку по глубинам обитания.

В процессе эволюции геномы этих видов накапливали мутации, изменявшие функции и структуры белков. Часть мутаций оказалась полезной в новых условиях и закрепилась отбором. Их поиск может дать полезную информацию о том, какие гены ответственны за приспособление к экстремальной среде. Мы рассматривали два механизма, меняющих геном в ходе освоения новых местообитаний: одиночные нуклеотидные замены в генах, кодирующих белки, и потерю генов.

Скорости мутаций и режим эволюции генов

Биоинформатика имеет дело прежде всего с анализом последовательностей нуклеотидов в генах и аминокислот в белках. Каким же образом она поможет понять, как археи приспосабливались к внешней среде?

В 1968 году японский биолог Мотоо Кимура предложил теорию молекулярной эволюции, популярную до сих пор. Согласно ей, существует три режима накопления одиночных замен в генах. Первый — нейтральная эволюция, когда мутации не изменяют структуру или функцию гена и соответствующего белка. Они характерны для участков ДНК, которые не слишком важны для выживаемости организма и не влияют на его приспособленность. В ходе эволюции такие мутации накапливаются в геномах с приблизительно постоянной скоростью, поэтому в молекулярной эволюции они служат эталоном времени. Процесс накопления таких замен даже назвали молекулярными часами по аналогии с атомными часами — эталоном времени в физике.

Другой режим — стабилизирующий отбор, под действием которого обычно находятся особо важные гены или их участки. Почти любая замена в них повредит продукт гена и уменьшит приспособленность организма. Скорость накопления мутаций при таком отборе тем ниже, чем важнее ген и чем меньше его функция связана непосредственно с внешней средой. Под действием стабилизирующего отбора часто находятся гены, участвующие в работе базовых систем клетки (так называемые гены домашнего хозяйства).

Третий режим эволюции — движущий отбор. Он характеризуется увеличенной скоростью накопления мутаций, так как в новых условиях они повышают приспособленность организма, придавая генам какие-либо новые свойства (например, возрастает устойчивость белков к воздействию повреждающих внешних факторов).

Как же отличить нейтральные мутации от остальных? В общем виде этот вопрос не решен, но ключ к нему дают особенности генетического кода и физико-химических свойств аминокислот. Известно, что 20 аминокислот, из которых состоят белки, кодируются 61 триплетом нуклеотидов (кодоном) из 64-х возможных (оставшиеся три триплета представляют собой «знаки препинания» генетического кода). Значит, одна аминокислота может кодироваться несколькими триплетами. Поэтому некоторые замены одного нуклеотида, меняя триплет, оставляют в белке ту же аминокислоту. Такие замены называют синонимическими. Замена, в результате которой в белке появляется другая аминокислота, называют несинонимическими. На рисунке 2 они показаны на примере триплета GAT, кодирующего аспарагиновую кислоту. М. Кимура предположил, что синонимические мутации идеально подходят на роль нейтральных, поскольку они «незаметны» для организма на уровне аминокислотной последовательности, структуры и функции белка. Поэтому скорость их накопления может служить эталоном. За прошедшее время его предположение в целом подтвердилось, хотя, как водится в природе, не бывает правил без исключений: иногда синонимические замены могут не быть нейтральными (например, в тех случаях, когда они нарушают скорость синтеза белка.

Замены в кодонах, используемые для установления режима эволюции гена, на примере аспарагиновой кислоты. Эта аминокислота кодируется двумя нуклеотидными триплетами GAT и GAC (слева). Для кодона GAT возможны девять мутаций с заменой одного нуклеотида. Результат замены показан справа, подчеркнуты нуклеотиды, которые были заменены в результате мутации. Синонимическая мутация показана прямым шрифтом. Остальные восемь — несинонимические и кодируют разные аминокислоты. Аспарагиновая и глутаминовая кислоты при нормальном рН отрицательно заряжены, валин, глицин, аланин, аспарагин и тирозин не имеют заряда, а гистидин имеет положительный заряд. Следовательно, две из восьми возможных несинонимических замен будут консервативными (показаны курсивом), а остальные — радикальными (показаны жирным шрифтом). Изображение «Химия и жизнь»

С другой стороны, для структуры и функции белка важны прежде всего физико-химические свойства аминокислот. Поэтому некоторые несинонимические замены могут оказаться вполне нейтральными. Например, аспарагиновая и глутаминовая кислоты очень сходны по своим физико-химическим свойствам и очень часто заменяются друг на друга в процессе эволюции. Такие замены, сохраняющие свойства аминокислоты, называют консервативными.

Двум видам бактерий или архей нужно много времени, чтобы окончательно разделиться, причем темпы мутирования у них высокие. Синонимические замены не всегда подходят в качестве эталона, зато консервативные вполне годятся на роль «нейтральных мутаций». Скорость их накопления, K_c можно принять за эталон. Скорость К_r накопления радикальных несинонимических замен, существенно изменяющих свойства аминокислот, служит характеристикой отбора. Чтобы определить важность гена и его режим эволюции, будем использовать отношение К_r/К_с, рассчитанное сравнением его нуклеотидной последовательности с родственной. В случае К_r/К_с ≈ 1 (нейтральная эволюция) функция гена не критична для организма. Если К_r/К_с < 1 (стабилизирующий отбор), ген чрезвычайно важен для выживания организма. Если К_r/К_с > 1 (движущий дарвиновский отбор), высокая изменчивость может свидетельствовать о том, что ген меняет свою функцию и быстро накапливает мутации, которые закрепляют его новое предназначение. Именно они привлекают биолога как гены-кандидаты, отвечающие за приспособление к изменившимся условиям среды.

Рис. 1. Эволюционная история бактерий рода Pyrococcus (P. furiosus, P. horikoshii и P. abyssi). Первым обособился P. furiosus (ветвь с), а после разошлись P. horikoshii и P. abyssi. Показаны глубины их местообитаний и предельные значения давлений, при которых эти виды выживают. P. horikoshii (ветвь b) утерял гены синтеза важных аминокислот и научился потреблять пептиды и аминокислоты из внешней среды. Изображение с сайта mccmb.genebee.msu.ru

Смысл нашей работы как раз и заключался в поиске таких генов, быстро эволюционирующих на тех этапах эволюции, когда виды пирококков расходились и меняли места обитания (ветви с, b, а и d филогенетического дерева на рис. 1).

Движущий отбор в геномах пирококков

Мы провели анализ 911 генов родственных белков, последовательности которых у трех видов пирококков похожи не менее чем на 50% (что гарантировало сходство их структуры и функции). Этот набор составил приблизительно половину от общего числа белков на геном.

Для 422 из 911 исследованных нами генов, то есть почти для половины, движущий отбор не обнаружен (К_r не превышала К_с). Они в ходе дивергенции трех видов архей изменялись несильно.

Оставшиеся гены эволюционировали под действием движущего отбора, по всей видимости, адаптируясь к изменившимся биотическим и абиотическим условиям среды. Из них 154 подвергались движущему отбору для ветви а (рис. 1); 208 — для b; 131 — для с; 168 — для d. Для большинства этих генов функция известна, и мы можем сказать, какие их функциональные классы более других удалились от исходного строения на разных ветвях филогенетического дерева.

Так, на ветви а, ведущей к P. abyssi, в основном отбирались гены системы транспорта и метаболизма неорганических ионов. (Похожий результат получили С. Кампанаро и его сотрудники (2008) при анализе пьезофильных линий бактерий Photobacterium profundum и Shewanella benthica.) Но по глубинам обитания P. abyssi наиболее близок к возможному общему предку трех исследованных нами видов (рис. 1), то есть в ходе его эволюции резкой смены давлений могло и не быть. Подавляющее большинство генов этой функциональной группы, затронутых движущим отбором, кодируют белки молекулярного комплекса, поддерживающего рН внутри клетки за счет обмена ионов Na⁺ и Н⁺ между цитоплазмой и внешней средой. Такая эволюция больше характерна для прокариот, обитающих в экстремальных рН. Вспомним, однако, что флюид «черного курильщика» кислый, а морская вода — слабощелочная. Возможно, P. abyssi перемещался не столько по глубине, сколько по горизонтали — ближе или дальше от «черного курильщика», и как раз по этой причине, в отличие от P. horikoshii, P. abyssi могут существовать на обедненных аминокислотами средах: при удалении от «курильщика» их концентрация падает.

Анализ ветви b, ведущей к P. horikoshii, показал, что под действием движущего отбора эволюционировали в первую очередь гены аппарата транскрипции. P. horikoshii утеряла блоки генов, отвечающие за синтез ряда аминокислот. Вероятно, часть аминокислот этот вид приспособился получать из внешней среды, что и повлекло за собой перестройку аппарата регуляции транскрипции.

На ветви с — дивергенции мелководного вида P. furiosus от общего глубоководного предка — движущему отбору подвергались гены аппарата трансляции. Изменение условий обитания здесь связаны прежде всего с уменьшением гидростатического давления. Хорошо известно, что у кишечной палочки и других бактерий при повышенном давлении рибосомы диссоциируют — разделяются на две субъединицы и перестают синтезировать белки, почему, собственно, клетки и гибнут. Известно также, что активность генов рибосомальных белков резко повышается с ростом давления. Мы предположили, что быстрое накопление радикальных замен в генах, связанных с работой рибосомы, направлено на ее стабилизацию при нормальных давлениях, непривычных для глубоководной клетки.

Наш анализ в целом показал, что наборы генов, подверженных движущему отбору, отличаются как по их числу, так и по распределениям функций для каждой из ветвей филогенетического дерева Pyrococcus, однако не слишком хорошо согласуются с глубиной местообитания. По сравнению с общим предком изменение глубин наибольшее для P. furiosus, наименьшие — для P. abyssi, а общее число подверженных движущему отбору генов наибольшее у P. horikoshii. По-видимому, смена биотопа по горизонтали — в пределах области рассеяния флюида «черного курильщика», и соответственно смена экологических ниш и субстратных предпочтений — не менее важная тенденция в эволюции трех видов Pyrococcus, чем смена биотопа по вертикали. P. abyssi оказался домоседом и перемещался преимущественно по горизонтали, P. furiosus — преимущественно по вертикали, a P. horikoshii — как по вертикали, так и по горизонтали, поэтому он оказался наиболее изменен в ходе эволюции. Смена субстратного предпочтения, вероятно, шла в ходе эволюции P. abyssi и P. horikoshii постепенно, как на ветви d (где движущий отбор сильнее всего был выражен для функции «транспорт и метаболизм нуклеотидов»), так и после дивергенции ветвей а и b (преобладание движущего отбора для генов P. abyssi с функцией «транспорт и метаболизм неорганических ионов»).

Мембраны сильно подвержены действию повышенных давлений. Тем не менее мы не нашли значимых следов движущего отбора в классах генов, связанных с функциями клеточных мембран, хотя у пьезофильных линий бактерий P. profundum и Sh. benthica такой отбор шел. Но пирококки — археи. Их мембраны, в отличие от бактериальных, содержат полиизопреновые цепочки, чьи метильные группы повышают прочность липидного слоя. По-видимому, такая структура мембран лучше всего подходит для высоких значений и температур, и давлений.

Стресс, эволюция и пирококки

Большинство прокариот обладает феноменальной способностью кратковременно выдерживать смертельные, казалось бы, изменения параметров окружающей среды (рис. 1). В основе лежит механизм стресса — кратковременного ответа жизненных систем на экстремальные внешние факторы. Но может ли такой механизм вносить свой вклад в эволюционную изменчивость видов?

Типичная стресс-реакция, как установил еще Ганс Селье, состоит из фазы тревоги, когда спешно активируются гены, обеспечивающие сопротивление стресс-фактору (стрессору), фазы резистентности, когда организм кратковременно приобретает устойчивость к стрессору, и фазы истощения. Смертоносны для организма первая и особенно последняя фаза. А во второй организм может чувствовать себя настолько комфортно, чтобы положить ее в основу новой эволюционной стратегии. Так, кашалот, например, регулярно пользуется этой фазой, чтобы поплавать на километровой глубине в течение часа, а то и пообедать там же.

В фазе резистентности активированы функции организма, ответственные за универсальное сопротивление многим повреждающим факторам, а не только стрессору, вызвавшему стресс. Селье назвал это явление перекрестной резистентностью.

Режим эволюции, при котором адаптивные физиологические реакции изменяют направления отбора, Дж. Болдуин еще в 1896 году назвал органической эволюцией и предположил, что должен быть механизм, позволяющий наследственно закреплять такие реакции.

В 30-е годы XX века Е. И. Лукин и И. И. Шмальгаузен, исследуя географическую и онтогенетическую изменчивость, предложили гипотезу генокопирования модификаций: отбор благоприятствует мутациям, повышающим вероятность проявления адаптивных модификаций (например, интенсивный рост шерсти у млекопитающих при длительном охлаждении) и автономизирующим их развитие от внешней среды (у арктических подвидов шерсть гуще, чем у их южных родственников).

Мы вспомнили об эффекте Болдуина, сравнив функциональные группы с высокой долей адаптивно эволюционирующих генов у трех видов пирококков и функциональные группы генов, экспрессия которых резко повышается при росте давлений у бактерии E. coli и дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Оказалось, что эти группы во многом совпадают, в частности по таким функциональным классам, как «транспорт и метаболизм нуклеотидов», «транскрипция», «трансляция». Но у E. coli и S. cerevisiae при пьезострессе наблюдалась еще и повышенная экспрессия генов «защитных механизмов», а у пирококков в целом для этой группы адаптивная эволюция не характерна, хотя по отдельным генам и отмечена.

Мы предположили, что в случае пирококков мы тоже наблюдаем генокопирование, но не онтогенетических модификаций, а кратковременных стресс-реакций. В отличие от модификаций, отбору практически не нужно тестировать адаптивность стресс-реакции. За счет перекрестной резистентности организм переживет действие самых разных стрессоров. Но такая адаптация несовершенна — организм погибнет в фазе истощения. Этого не произойдет, если отбор затронет сравнительно небольшое количество генов стресса, так, чтобы оптимизировать выход из фазы истощения, своевременно ликвидировав вредные последствия стресса. То есть на первых стадиях эволюции происходит приспособление не к изменившейся среде, а к собственному стрессу, автономизация от него.

Конечно, сравнительный анализ всего трех геномов не дает точных ответов на вопросы о всех механизмах приспособления организмов к экстремальным условиям. Однако секвенирование геномов в настоящее время — достаточно рутинная процедура, и скоро геномов с известной последовательностью нуклеотидов станет больше, а наши ответы — точнее.

Авторы выражают благодарность СО РАН за финансовую
поддержку работы в рамках интеграционного проекта 109.

Что еще почитать об эволюции и адаптации микроорганизмов:

1) Campanaro S., Treu L., Valle G. Protein evolution in deep sea bacteria: an analysis of amino acids substitution rates, ВМС Evol. Biol., 2008, V. 8:313.
2) Gunbin K.V., Afonnikov D.A., Kolchanov N.A. (2009) Molecular evolution of the hyperthermophilic archaea of the Pyrococcus genus: analysis of adaptation to different environmental conditions, ВМС Genomics, 10, 639.
3) Кимура М. Молекулярная эволюция: теория нейтральности. М.: Мир, 1985.