SERS — изучение цитохрома с в живых митохондриях

Эвелина Никельшпарг
«Природа» №3, 2016

Об авторе Эвелина Ильинична Никельшпарг — аспирантка кафедры биофизики биологического факультета Московского государственного университета им. М. В. Ломоносова. Область научных интересов — структура и функционирование митохондрий, спектроскопия гигантского комбинационного рассеяния, фотобиология. Победитель конкурса «Био/мол/текст» 2015 г. в номинации «Своя работа».

Жалюзи опущены. Выключен свет. Мы погружены во мрак. Капля мутной жидкости падает на серебряную подложку. Вспышка зеленого света. 30 секунд. Спектр. Так начинается наш длинный рабочий день. А теперь обо всем по порядку.

Капля мутной жидкости — это суспензия митохондрий, клеточных органелл размером всего 1–2 мкм. Правда, органеллами они стали не сразу: согласно теории симбиогенеза, митохондрии появились в эукариотических клетках как бактерии-симбионты и за миллиарды лет обросли множеством функций.

В митохондриях протекают сложнейшие биохимические и биофизические процессы. Основные из них: окисление питательных веществ и производство молекул АТФ — универсального источника энергии для большинства биологических процессов в клетках. Кроме того, митохондрии участвуют в инициации апоптоза, старении клеток, продукции активных форм кислорода, метаболизме лекарств, выработке тепла, запасают в себе ионы кальция, синтезируют некоторые гормоны и т. д. [1].

Митохондрии обладают столь широким спектром функций, что нарушение их работы может стать причиной множества болезней: различных видов миопатий (атрофии мышц), сердечно-сосудистых заболеваний, диабета и др. [2]. Большинство из них связаны с мутациями в генах, кодирующих белки митохондрий, но может быть и наоборот: некоторые заболевания или неправильный образ жизни (ожирение, употребление наркотиков и т. д.) могут привести к нарушению работы митохондрий. Механизмы этих процессов волнуют прежде всего биологов, но и для физиков митохондрии представляют большой интерес как преобразователи энергии и фактически белковый электропровод [3].

Как все устроено

Митохондрии состоят из двух мембран: внешней, проницаемой для ионов и некоторых белков, и внутренней, где находятся четыре белковых комплекса дыхательной цепи (или электрон-транспортной цепи, ЭТЦ) и АТФ-синтаза (рис. 1). Внутренняя мембрана образует множество складок, называемых кристами (от лат. crista — гребень), и ограничивает внутреннее пространство — матрикс, где содержатся ферменты цикла трикарбоновых кислот, или цикла Кребса. Также в митохондриях есть подвижные элементы комплекса дыхательной цепи: водорастворимый белок цитохром с и жирорастворимый убихинон, также известный как кофермент Q.

Рис. 1. Комплексы дыхательной цепи, локализованные во внутренней мембране митохондрий. I — фермент НАДН-дегидрогеназа окисляет НАДН с передачей двух электронов на убихинон (Q), при этом из матрикса в межмембранное пространство поступает четыре протона; II — фермент сукцинатдегидрогеназа связывает кофактор ФАД и окисляет сукцинат до фумарата с восстановлением Q; так как эта реакция дает меньше энергии, чем окисление НАДН, комплекс II не осуществляет перенос электронов; III — цитохром bc₁-комплекс (тип цитохрома показан в серых кружках) катализирует две реакции: окисление Q и восстановление цитохрома с, при этом два протона, высвобождаемые QH₂, уходят в межмембранное пространство; IV — фермент цитохромоксидаза оксисляет цитохром с (зеленые кружки) и восстанавливает кислород (электроны переносятся на кислород, и протоны перекачиваются из матрикса в межмембранное пространство, при этом кислород восстанавливается до воды), затем АТФ-синтаза использует полученную энергию (протоны) для синтеза АТФ из АДФ и неорганического фосфата. Черными стрелками показан транспорт электрона, пунктирной стрелкой — диффузия цитохрома с от комплекса III к IV, зелеными стрелками — перенос протона

Принцип работы дыхательной цепи — окисление субстратов, поступающих из цикла Кребса, и перенос электронов от них с помощью кофакторов ЭТЦ на конечный акцептор — кислород. Есть определенная закономерность в последовательности переноса электронов: они поступают от донора с более отрицательным окислительно-восстановительным потенциалом, или редокс-потенциалом (Е_red/ox, от англ. reduction — восстановление, oxidation — окисление), к акцептору с более положительным Е_red/ox. Таким образом, электрон как будто движется вниз по течению, определяемому Е_red/ox переносчиков электрона. Во время переноса электронов некоторые комплексы дыхательной цепи закачивают протоны из матрикса в межмембранное пространство, тем самым создавая электрохимический потенциал на внутренней мембране митохондрий, который используется для синтеза АТФ (см. рис. 1) [1].

Замечу, что митохондрии — очень популярный объект исследования. Их изучали такие корифеи науки, как Х. А. Кребс, П. Д. Митчелл, А. Л. Ленинджер, Б. Чанс, В. П. Скулачев и многие другие, и благодаря им известно об этих органеллах уже немало, но еще не все. Многие митохондриальные процессы и свойства переносчиков электронов до сих пор не изучены, что связано в первую очередь с отсутствием подходящих неинвазивных методик. В прошлом году мы, сотрудники лаборатории биофизики клетки биофака МГУ им. М. В. Ломоносова, вместе с коллегами, работающими на других факультетах нашего университета и в Институте общей и неорганической химии им. Н. С. Курнакова РАН, а также с учеными из Германии и Дании создали методику для селективного исследования конформации гема цитохрома с непосредственно в живых митохондриях [4]. Что же такое конформация гема и почему она важна?

Редокс-потенциал и конформация гема

Если приглядеться к комплексам дыхательной цепи, локализованным во внутренней мембране митохондрий, то в трех из них можно увидеть цитохромы — гемсодержащие белки, которые служат кофакторами, участвующими в переносе электронов, и еще один, который диффундирует в межмембранном пространстве (см. рис. 1). Всего в митохондриях имеется три типа цитохромов — а, b и с. Они очень похожи, отличаются лишь боковыми радикалами (рис. 2).

Рис. 2. Гемы цитохромов разных типов. Каждый гем состоит из четырех пятичленных азотсодержащих циклов (порфиринов), связанных между собой [1]. Атомы азота координируют атом железа (Fe). Гемы отличаются боковыми группами, и только гем типа с связан с белком ковалентно

Во время переноса электрона меняется редокс-состояние атома железа (Fe³⁺/Fe²⁺), который располагается в геме цитохромов, что приводит к изменению его конформации. Эти два параметра (Е_red/ox и конформация гема) всегда связаны друг с другом. Конформация гема цитохромов также зависит от белкового окружения [5, 6]. А так как Е_red/ox определяет эффективность переноса электрона, то конформация гема — вещь важная. Кроме того, чтобы произошел перенос электрона с одного цитохрома на другой, нужно, чтобы их гемы находились на определенном расстоянии друг от друга и были правильно ориентированы. Поэтому любые изменения в цитохромах могут отражаться на эффективности переноса электрона, т.е. на работе всей дыхательной цепи и, как следствие, энергообеспечении клеток [7, 8].

Наиболее интересен в этом отношении цитохром с. Так как это единственный мобильный переносчик электронов, курсирующий в межмембранном пространстве (все остальные цитохромы заякорены в комплексах ЭТЦ), он наиболее подвержен изменениям, которые могут происходить в митохондриях. Помимо этого выход цитохрома с запускает каскад реакций, ведущих к апоптозу, и в этом процессе тоже важен его редокс-потенциал [9].

Возникает вопрос, как оценить Е_red/ox и понять, в какой конформации и в каком редокс-состоянии находится гем цитохрома с в митохондриях?

Численно определить Е_red/ox можно с помощью электрохимических методов. Однако для этого нужные комплексы ЭТЦ изолируют и помещают в совершенно иные условия среды, что может само по себе изменить их свойства. Благодаря таким мощным методам, как ядерно-магнитный резонанс и рентгеноструктурный анализ, мы знаем, в какой конформации находятся белки и кофакторы дыхательной цепи в окисленной и восстановленной форме. Но нас интересует их состояние в максимально естественных условиях, а также соотношение этих состояний при работе дыхательной цепи.

Существует несколько неинвазивных методов для определения окислительно-восстановительного состояния цитохромов. Например, абсорбционная спектроскопия, основанная на использовании способности вещества к избирательному поглощению световой энергии. Спектр поглощения митохондрий включает спектр всех имеющихся цитохромов в митохондриях, а также небелкового компонента — ФАД, который входит в состав фермента сукцинатдегидрогеназы (II компонент дыхательной цепи, см. рис. 1). Но из-за того, что все типы цитохромов очень похожи и, соответственно, обладают схожими спектрами поглощения, а их окислительно-восстановительное состояние все время меняется при нормальной работе дыхательной цепи, сложно оценить вклад различных цитохромов в спектр [10].

По спектрам флуоресценции НАДН и ФАД⁺ можно примерно оценить редокс-состояние только I и II комплексов дыхательной цепи. А по потенциалу на внутренней мембране митохондрий можно судить только о работе митохондрии в целом [11].

Напрямую получение информации о конформации и редокс-состоянии цитохрома с в целой и функционирующей (интактной) митохондрии — это крайне сложная задача, ведь его конформация постоянно меняется при работе дыхательной цепи, он диффундирует и взаимодействует с мембранными комплексами. Наличие метода, который позволял бы это сделать, значительно облегчило бы задачу и расширило знания о влиянии цитохрома с на активность ЭТЦ и его вкладе в развитие митохондриальных патологий.

Новые возможности старого метода

Риc. 3. Рассеяние света на молекуле, устройство спектров комбинационного рассеяния света (КР) и схема переходов между колебательными подуровнями и электронными уровнями молекулы. Спектры КР представляют зависимость интенсивности сигнала от частотного сдвига, Δν [см⁻¹], а не от длины волны. В этом случае спектры не зависят от выбора лазера и их можно сравнивать. S₀ и S₁  — основной и первый возбужденный электронные уровни со структурой колебательных подуровней. Серой пунктирной линией обозначен виртуальный подуровень (в случае, когда энергии кванта не хватает для перехода на существующий подуровень). 1 — поглощение кванта инфракрасного (ИК) излучения приводит к переходу молекулы на новый колебательный подуровень; 2 — стоксово КР наблюдается, когда молекула находится в невозбужденном состоянии и при взаимодействии со светом переходит на более высокий колебательный подуровень, при этом энергия рассеянного света меньше энергии возбуждающего света (зеленый → оранжевый); 3 — рэлеевское рассеяние, не приводящее к изменению энергии (и, соответственно, длины волны) возбуждающего света; 4 — антистоксово КР наблюдается в случае, если молекула находится в возбужденном состоянии и при взаимодействии со светом переходит на нижний колебательный подуровень, при этом энергия рассеянного света будет больше энергии возбуждающего света (зеленый → синий); 5 — флуоресценция: квант света вызывает электронно-колебательный переход, после чего наблюдается релаксация (бордовая фигурная стрелка) и испускание света с меньшей энергией (синий → красный)

Исторически в нашей лаборатории для изучения конформационных состояний различных биологических молекул используют метод комбинационного рассеяния света (КР). Это явление основано на эффекте неупругого (рамановского, или комбинационного^*) рассеяния оптического излучения на молекулах вещества. При обычном (упругом, или рэлеевском) рассеянии частота (и длина волны) излучения не меняется, а при неупругом — меняется. Это выражается в появлении дополнительных линий (линий КР) на спектре рассеяния (рис. 3). Какую же информацию он несет?

Под «взаимодействием» света с молекулой подразумевается энергетический обмен между фотонами и колебательными подуровнями энергии молекулы. Это означает, что спектр КР несет в себе информацию о колебаниях атомов в молекулах исследуемого вещества. Строго говоря, разность частот возбуждающего и рассеянного света (Δν) характеризует нормальные частоты колебаний молекулы в целом. Большинство пиков на спектре КР обусловлено колебаниями сразу нескольких химических связей в молекуле, но некоторые пики описывают колебания определенных групп атомов (рис. 4) [12, 13]. С помощью таких ключевых колебаний можно определить, с чем мы имеем дело — с липидами, белками, ДНК, порфиринами или другими молекулами. И для каждой молекулы будет свой неповторимый спектр КР — нечто вроде «отпечатков пальцев» молекулы. И так же, как по отпечаткам пальцев можно различить близнецов, по спектрам КР можно отличить схожие по строению молекулы. Поэтому метод чрезвычайно популярен среди химиков-аналитиков и физиков, а также применяется в археологии, экологии, геологии и даже в криминалистике.

Первые биологические эксперименты с использованием метода КР велись еще в 1935 г. на аминокислотах. Однако, повторюсь, работы на изолированных молекулах не столь интересны для биологов, а для работы на целых клетках сигнал КР обладает низкой интенсивностью (и это один из существенных недостатков метода), поэтому метод не получил широкого распространения. И только в 1990 г., после совмещения КР-спектрометра с конфокальным микроскопом, появилась возможность регистрировать КР целых клеток или отдельных их участков. В последние годы метод наконец-то приобрел популярность, притом заслуженную, так как КР-спектроскопия обладает существенными преимуществами перед другими методами, и главное, позволяет получать эксклюзивную информацию.

Основное преимущество КР-спектроскопии — неинвазивность, т.е. с помощью этого метода можно изучать биохимический состав клеток, не разрушая их. Кроме того, не нужно использовать метки или зонды, как для флуоресцентной микроскопии. Это означает, что можно изучать систему (в нашем случае клетку) в естественных условиях, а это крайне важно, учитывая, что многие из существующих меток (как флуоресцентных, так и изотопных) токсичны. К тому же исчезает проблема выцветания меток и появляется возможность исследовать небольшие молекулы, к которым трудно «пришить» метку. Важно также, что метод КР позволяет работать с водными растворами, в том числе с физиологическими буферами, в отличие от ИК-спектроскопии, так как вода сильно поглощает в ИК-области.

Рис. 4. Гем типа b, который содержится в гемоглобине эритроцитов, и его спектр КР [13]. Различные группы атомов и соответствующие им пики обозначены одним цветом

Что касается эксклюзивной информации, то это в первую очередь информация о конформации исследуемых молекул и микроокружении функциональных групп. А от этих параметров может зависеть и активность молекул в клетке, и взаимодействие с другими молекулами, т.е. то, что влияет на работу целой клетки. Исследовать конформацию молекул — это сложная экспериментальная задача. Для ее решения можно использовать ИК-спектроскопию, но опять же только на высушенных образцах. Можно применять более сложные и дорогие технологии, такие как рентгеноструктурный анализ и ЯМР. Эти методы позволяют получать целостную картину расположения атомов в молекуле, но очевидно, их пока нельзя использовать для изучения молекул в живой клетке. А КР-спектроскопию можно: в зависимости от того, в какой конформации находится молекула, атомы будут колебаться по-разному, что отразится на спектрах.

К митохондриям от чистого сердца

О неинвазивном методе исследования цитохромов митохондрий в клетках сотрудники нашей лаборатории задумывались уже несколько лет назад, когда исследовали влияние окислительного стресса на клетки сердечной мышцы (кардиомиоциты) методом комбинационного рассеяния света [14]. Тогда удалось выяснить, что спектры КР разных типов цитохромов и миоглобина (который, как и гемоглобин, содержит гем типа b) можно различать по спектрам КР интактных клеток и даже определять их окислительно-восстановительное состояние. Позже Н. А. Браже с другими сотрудниками успешно провела подобное исследование на целом сердце, т.е. in situ (рис. 5) [15].

Рис. 5. Регистрация спектра КР целого сердца [15]

Однако у цитохромов есть одна особенность — только для восстановленных их форм спектр КР интенсивен. Если ориентироваться только на этот критерий, можно потерять важную информацию об изменениях в исследуемой системе, ведь интенсивность зависит и от количества молекул, и от выраженности тех или иных колебаний, и от других параметров. К тому же для определения точного положения пиков большинство исследователей, имеющих дело с цитохромами, вынуждены искусственно восстанавливать образцы, что заведомо нарушает их нативность.

Отчасти проблему решили японские ученые. Они определили, какие пики на спектре КР характерны только для восстановленных цитохромов, а какие — только для окисленных [16]. Однако проблема интенсивности спектров по-прежнему сохранялась, и нужно было ее решать.

Один из способов усилить сигнал КР — это поместить исследуемую молекулу вблизи наночастицы благородного металла, например золота или серебра. Эти металлы обладают свободными поверхностными электронами. Квант их коллективных колебаний называется плазмоном. Если частота падающего света входит в резонанс с частотой колебаний поверхностных электронов металла, то возникает эффект плазмонного резонанса, который приводит к многократному усилению электромагнитного излучения вблизи наночастицы. Этот эффект используют в методе поверхностного плазмонного резонанса (surface plasmon resonance, SPR), в абсорбционной и флуоресцентной спектроскопии. Но нам нужен был способ, позволяющий усилить именно КР-сигнал. И для этого существует спектроскопия гигантского комбинационного рассеяния (SERS, англ. Surface enhanced Raman spectroscopy).

Спектры КР и SERS цитохрома с хорошо известны [17, 18]. И что самое замечательное, спектры SERS окисленного и восстановленного цитохрома с практически не отличаются по интенсивности. Так почему бы не зарегистрировать спектр SERS митохондрий?

Идея пришла от профессора Копенгагенского университета О. В. Сосновцевой, с которой наша лаборатория сотрудничает не первый год. На тот момент было только две работы по изучению митохондрий методом SERS и его разновидностью TERS (Tip-enhanced Raman spectroscopy). В первой работе исследователи регистрировали спектр SERS только от белков и липидов митохондрий, но не от цитохромов, а во второй работе — использовали не нативные, а высушенные митохондрии [19, 20].

Но как применить метод SERS для изучения цитохромов живых митохондрий? Прежде чем ответить на этот вопрос, переместимся в недалекое прошлое.

Междисциплинарность — залог успеха

В 2010 г., когда возник интерес к нанотехнологиям, академик Ю. Д. Третьяков (в то время декан факультета наук о материалах МГУ) инициировал межфакультетское сотрудничество с биологами для проведения совместных исследований методом SERS. Так началась совместная работа нашей лаборатории под руководством Г. В. Максимова с группой химиков-материаловедов во главе с Е. А. Гудилиным.

Дело в том, что SERS — метод непростой и требует исключительно междисциплинарного подхода. Каждый биологический объект уникален, и чтобы регистрировать от него сигнал SERS, нужно разрабатывать особые наноструктуры, которые усиливали бы сигнал от нужного объекта, при этом не повреждали его и выдерживали «атаку» физиологических многокомпонентных буферов.

Большинство работ, связанных с SERS, предполагают адсорбцию молекул на поверхности наноструктур, пусть даже введенных внутрь клетки [21]. Это связано с тем, что усиление сигнала КР наблюдается только на очень небольшом расстоянии от поверхности металла [22]. Однако такой подход не всегда удовлетворяет запросам биологов. В идеале усиление сигнала должно распространяться на достаточно большое расстояние (только так можно работать с целыми клетками и органеллами, не повреждая их), и желательно не вводить ничего внутрь. Для этой цели нужно было разработать специфический дизайн наноструктур и придумать методы их синтеза, чем и занялась группа Гудилина.

Наконец длительные и упорные попытки разработать такие структуры для исследования живых клеток увенчались успехом. В 2012 г. дебютировали наноструктурированные подложки для усиления сигнала от примембранного гемоглобина в интактных эритроцитах [13]. За счет определенной морфологии наноструктур удалось получить усиление сигнала на расстоянии более 10 нм, т.е. больше толщины мембраны эритроцита.

Раз это удалось сделать для эритроцитов, то можно сделать и для митохондрий!

Долгожданный спектр SERS митохондрий

Жалюзи опущены. Выключен свет. Комната погружена во мрак. Капля суспензии падает на серебряную подложку. Вспышка зеленого света. 30 секунд. Спектр. Тот самый долгожданный спектр SERS от изолированных сердечных митохондрий был получен! Оставалось только понять, от каких именно структур в митохондриях исходит сигнал.

Рис. 6. Схема эксперимента на изолированных сердечных митохондриях, помещенных на серебряную наноструктурированную поверхность и облученных зеленым лазером [4]. На рисунке показаны размеры мембраны, межмембранного пространства и участков комплекса дыхательной цепи. VDAC — потенциал-зависимый анионный канал, FCCP — протонофор, разобщающий электронный транспорт и синтез АТФ, олигомицин — ингибитор АТФ-синтазы, зеленые и серые кружки — цитохромы

С учетом размеров компонентов митохондрий (рис. 6) и того, что усиление наблюдается на расстоянии нескольких нанометров от наноструктур, можно было предположить, что спектр SERS митохондрий будет преимущественно спектром цитохрома с, так как этот цитохром наиболее близко подходит ко внешней мембране митохондрий и, соответственно, к наноструктурам. В то же время остальные цитохромы закреплены в комплексах внутренней мембраны. Это также подтверждалось при моделировании эффектов усиления КР серебряными наноструктурами, которые были использованы в работе. Группа наших коллег из лазерного центра Ганновера показала, что сложная морфология подложки со множеством углублений, в которые могут попадать митохондрии, позволила получать усиление на большом расстоянии (более 10 нм). А иерархическое устройство самих наноструктур увеличивало число мест контакта с мембраной митохондрий и, следовательно, количество молекул цитохрома с, от которых можно было зарегистрировать сигнал SERS. Если использовать те же наночастицы серебра, просто присоединенные к плоской подложке, то особого усиления не произойдет, что и подтверждалось в эксперименте (рис. 7).

Рис. 7. Изображения иерархических наноструктур (вверху слева) и наночастиц на плоской поверхности (справа), полученные на сканирующем электронном микроскопе [4]. Под каждой микрофотографией приведены соответствующие им модели взаимодействия митохондрий с этими структурами

И действительно, полученный спектр SERS митохондрий соответствовал спектрам цитохрома с. При использовании зеленого лазера в качестве возбуждающего света можно регистрировать сигнал только от цитохромов b и с, но не от цитохрома а, что облегчает задачу расшифровки спектров. Несмотря на схожесть структуры цитохромов типа b и с, они имеют ключевые пики на спектре, благодаря которым их нельзя перепутать (рис. 8). Таким образом, используемые наноструктуры давали усиление на расстоянии, достаточном, чтобы зарегистрировать спектры от цитохрома с, но недостаточно большом, чтобы увидеть пики цитохромов b. А это как раз то, что нужно! Благодаря методу SERS теперь можно исследовать селективно редокс-состояние и конформацию именно цитохрома с в живых функционирующих митохондриях.

Рис. 8. Спектры SERS интактных митохондрий (слева), помещенных на серебряную наноструктурированную поверхность [4]: 1 — спектр искусственно восстановленных цитохромов митохондрий; 2 — спектр активно функционирующих интактных митохондрий. Для сравнения справа приведен спектр SERS эритроцитов, который соответствует спектру гема типа b, и спектр окисленного изолированного цитохрома с. Красным цветом отмечены пики, по которым можно четко отличить спектр гемов b и с

Как и ожидалось, спектры SERS цитохрома с митохондрий оказались очень чувствительны к изменению его окислительно-восстановительного состояния. Для этого было исследовано два воздействия: внесение переносчика протонов (протонофора) FCCP и ингибитора АТФ-синтазы олигомицина. FCCP встраивается во внутреннюю мембрану митохондрий и начинает переносить протоны из межмембранного пространства в матрикс, минуя протонные каналы АТФ-синтазы. В результате этого исчезает электрохимический потенциал и прекращается синтез АТФ. Это явление называют разобщением дыхания и фосфорилирования. В итоге количество АТФ снижается, а АДФ увеличивается [23]. В таком случае возрастает количество поглощенного кислорода и скорость окисления субстратов, а следовательно, и количество окисленных молекул цитохрома с, что очень хорошо видно на спектрах SERS. И наоборот, добавление ингибитора синтеза АТФ — олигомицина, который приводит к увеличению электрохимического градиента на фоне снижения скорости дыхания, увеличивает количество восстановленных молекул цитохрома с, что также выражено на спектрах SERS митохондрий. Таким образом, спектры SERS митохондрий, являясь спектрами исключительно цитохрома с, оказались чувствительны к изменениям его конформации и редокс-состояния в процессе работы митохондрий.

***

Спектроскопия гигантского комбинационного рассеяния позволяет многократно усилить сигнал КР от молекул вблизи наночастиц металла. Однако для проведения успешных экспериментов необходимо учитывать свойства как биологического объекта, так и наноструктур. По словам одного из главных авторов проекта Н. А. Браже, ключевым моментом нашего достижения стал междисциплинарный подход к работе, в которую были вовлечены биологи, химики и физики. Результатом такого подхода стало создание уникальной методики селективного определения редокс-состояния и конформации цитохрома с в живых функционирующих митохондриях, помещенных на специальную наноструктурированную поверхность. Разработанная методика поможет восполнить пробелы в наших знаниях о свойствах и поведении переносчиков электрона в митохондриях. Она также может быть использована для разработки диагностических тестов для раннего выявления патологий митохондрий, чем и планируется заниматься в ближайшее время.

Работа выполнена при поддержке Российского научного фонда (проект 14-13-00871) и Российского фонда фундаментальных исследований (проект 14-04-31883-mol-a).

^* Впервые появление новых линий в спектре рассеянного света на кристаллах кварца наблюдали в 1928 г. наши соотечественники Г. С. Ландсберг и Л. И. Мандельштам, которые назвали увиденное комбинационным рассеянием света. Вскоре это явление наблюдали индийские ученые Ч. В. Раман и К. С. Кришнан на жидкостях, используя в качестве источника света солнечные лучи. Впоследствии за открытие эффекта неупругого рассеяния света только Раман был удостоен Нобелевской премии (1930), а метод, основанный на этом оптическом эффекте, стал носить его имя — рамановская спектроскопия (Raman spectroscopy, RS). Однако в русскоязычной литературе чаще используется название, введенное Ландсбергом и Мандельштамом, — «комбинационное» рассеяние, спектр которого составляет комбинация частот возбуждающего света и собственных колебаний молекулы [12].

Литература
1. Nelson D. L., Cox M. M. Lehninger Principles of Biochemistry. 5th ed. N. Y., 2008.
2. Vafai S. B., Mootha V. K. Mitochondrial disorders as windows into an ancient organelle // Nature. 2012. V. 491. P. 374–383. DOI: 10.1038/nature11707.
3. Moore L., Gust D., Moore T. A. Bio-inspired constructs for sustainable energy production and use // L’Actualité Chim. 2007. № 308–309. P. 50–56.
4. Brazhe N. A., Evlyukhin A. B., Goodilin E. A. et al. Probing cytochrome c in living mitochondria with surface-enhanced Raman spectroscopy // Sci. Rep. 2015. V. 5. Article number 13793. DOI: 10.1038/srep13793.
5. Battistuzzi G., Borsari M., Cowan J. A., Ranieri A., Sola M. Control of cytochrome c redox potential: axial ligation and protein environment effects // J. Am. Chem. Soc. 2002. V. 124. P. 5315–5324. DOI: 10.1021/ja017479v.
6. Dolla A., Blanchard L., Guerlesquin F., Bruschi M. The protein moiety modulates the redox potential in cytochromes c // Biochimie. 1994. V. 76. P. 471–479. DOI: 10.1016/0300-9084(94)90171-6.
7. Solmaz S. R. N., Hunte C. Structure of complex III with bound cytochrome c in reduced state and definition of a minimal core interface for electron transfer // J. Biol. Chem. 2008. V. 283. P. 17542–17549. DOI: 10.1074/jbc.M710126200.
8. Ma J. G., Zhang J., Franco R. et al. The structural origin of nonplanar heme distortions in tetraheme ferricytochromes c3 // Biochemistry. 1998. V. 37. P. 12431–12442. DOI: 10.1021/bi981189i.
9. Brown G. C., Borutaite V. Regulation of apoptosis by the redox state of cytochrome c // Biochim. Biophys. Acta. 2008. V. 1777. P. 877–881. DOI: 10.1016/j.bbabio.2008.03.024.
10. Chess D. J., Billings E., Covian R. et al. Optical spectroscopy in turbid media using an integrating sphere: mitochondrial chromophore analysis during metabolic transitions // Anal. Biochem. 2013. V. 439. P. 161–172. DOI: 10.1016/j.ab.2013.04.017.
11. Starkov A., Fiskum G. Regulation of brain mitochondrial H₂O₂ production by membrane potential and NAD(P)H redox state // J. Neurochem. 2003. V. 86. P. 1101–1107. DOI: 10.1046/j.1471-4159.2003.01908.x.
12. Горелик В. Комбинационное рассеяние света // Соросовский образовательный журнал. 1997. V. 6. P. 91–96.
13. Semenova А. А., Goodilin E. А., Brazhe N. А. et al. Planar SERS nanostructures with stochastic silver ring morphology for biosensor chips // J. Mater. Chem. 2012. V. 22. P. 24530–24544. DOI: 10.1039/C2JM34686A.
14. Brazhe N. A., Treiman M., Brazhe A. R. et al. Mapping of redox state of mitochondrial cytochromes in live cardiomyocytes using Raman microspectroscopy // PLoS One. 2012. V. 7. e41990. DOI: 10.1371/journal.pone.0041990.
15. Brazhe N. A., Treiman M., Faricelli B. et al. In situ Raman study of redox state changes of mitochondrial cytochromes in a perfused rat heart // PLoS One. 2013. V. 8. e70488. DOI: 10.1371/journal.pone.0070488.
16. Kakita M., Kaliaperumal V., Hamaguchi H. Resonance Raman quantification of the redox state of cytochromes b and c in-vivo and in-vitro // J. Biophotonics. 2012. V. 5. P. 20–24. DOI: 10.1002/jbio.201100087.
17. Hu S., Morris I. K., Singh J. P. et al. Complete assignment of cytochrome c resonance Raman spectra via enzymic reconstitution with isotopically labeled hemes // J. Am. Chem. Soc. 1993. V. 115. P. 12446–12458. DOI: 10.1021/ja00079a028.
18. Delfino I., Bizzarri A. R., Cannistraro S. Single-molecule detection of yeast cytochrome c by Surface-Enhanced Raman Spectroscopy // Biophys. Chem. 2005. V. 113. P. 41–51. DOI: 10.1016/j.bpc.2004.07.006.
19. Karataє O. F., Sezgin E., Aydin O. et al. Interaction of gold nanoparticles with mitochondria // Colloids Surf. B. Biointerfaces. 2009. V. 71. P. 315–318. DOI: 10.1016/j.colsurfb.2009.02.020.
20. Vitol E. A., Orynbayeva Z., Bouchard M. J. et al. In situ intracellular spectroscopy with surface enhanced Raman spectroscopy (SERS)-enabled nanopipettes ACS // Nano. 2009. V. 3. P. 3529–3536. DOI: 10.1021/nn9010768.
21. Kneipp J., Kneipp H., Wittig B. et al. Novel optical nanosensors for probing and imaging live cells // Nanomedicine. 2010. V. 6. P. 214–226. DOI: 10.1016/j.nano.2009.07.009.
22. Moskovits M. Surface roughness and the enhanced intensity of Raman scattering by molecules adsorbed on metals // J. Chem. Phys. 1978. V. 69. P. 4159–4161. DOI: 10.1063/1.437095.
23. Северин Е. С. Биохимия. М., 2003.