Метабаркодинг и метагеномика почв

Трехмерная визуализация бактериального разнообразия ризосферы кукурузы на основе биоинформационного анализа их филогенетической взаимосвязи генов 16S рРНК. Источник: https://www.soil-metagenomics.org/

Появление молекулярно-генетических методов метабаркодинга и метагеномики, базирующихся на выделении тотальной ДНК из почвы и последующем ее анализе, стало новым этапом в развитии почвенной биологии. Эти методы предоставили прямой доступ к колоссальному генетическому разнообразию «некультивируемого большинства» микроорганизмов в почве. Оказалось, что традиционные представления о таксономическом составе и экологии микробного населения почв требуют пересмотра и переосмысления. В обзоре рассмотрены вопросы терминологии, специфики почвы как объекта исследования метабаркодинга и метагеномики, а также успехов, проблем и перспектив данных научно-исследовательских подходов.

Почва является наиболее богатой средой с точки зрения микробного разнообразия. Один грамм почвы может содержать миллиарды или десятки миллиардов клеток прокариот и несколько километров грибного мицелия. Долгое время изучение микробного состава почв ограничивалось методом культивирования на питательных средах. Однако еще в середине 1980-х годов стало понятно, что те микробные колонии, которые культивируются на чашках Петри, составляют лишь незначительную долю (0.1–5%) от общего разнообразия микроорганизмов в почве.

Появление молекулярно-биологических методов, базирующихся на выделении тотальной микробной ДНК из почвы и последующем ее анализе, стало новым этапом в развитии почвенной микробиологии. Оказалось, что традиционные представления о таксономическом составе и экологии микробного населения почв требуют пересмотра и переосмысления. Двумя главными способами изучения почвенной ДНК микроорганизмов в настоящее время являются метагенетический и метагеномный подходы. Метагеномный подход основан на анализе метагенома ‒ совокупного генома какого-либо сообщества организмов. Метагенетический анализ рассматривает совокупность отдельных целевых генов. Метабаркодинг можно считать методическим решением, лежащим в основе мета-генетики. Под термином метабаркодинг понимается идентификация таксономического состава сообщества из образцов окружающей среды путем амплификации и высокопроизводительного секвенировании последовательностей маркерных генов-баркодов (например, 16S для прокариот, ITS для грибов и 18S для большинства эукариот). Данные подходы дали возможность прямого доступа к колоссальному генетическому разнообразию «некультивируемого большинства» микроорганизмов в почве. Последние исследования показывают, что в десяти граммах почвы может находиться до 10⁶ видов бактерий и архей.

Метагеномные исследования почв всё еще мало распространены. Это связано, прежде всего, с недостаточной глубиной секвенирования (количество раз, которое был отсеквенирован каждый нуклеотид; определяет точность позиции нуклеотида в последовательности), которую могут дать современные секвенаторы, а также с очень высокой стоимостью такого анализа. Кроме того, большой проблемой является обработка и интерпретация результатов. Получающийся на выходе почвенный метагеном представляет собой иерархическую структуру, в которой идентифицируемые гены обитающих в почве организмов собираются в функциональные субсистемы по принципу единства выполняемой функции (рис. 1). В состав метагенома входят функциональные субсистемы генов, ответственные за метаболизм белков, жиров и углеводов, вирулентность, дыхание, отклик на стресс и т.д. На более низком иерархическом уровне возможен анализ доли генов, ответственных за процессы цикла углерода и азота, синтез или разложение определенных соединений. Таким образом, метагеном почвы является ее функциональным профилем, составленным из генетической информации. Метагеномные исследования весьма эффективны для поиска новых метаболитов (прежде всего, антибиотиков), ферментов и биоактивных молекул. Также на основе анализа генов в геноме можно прогнозировать и подбирать условия выделения в чистую культуру некультивируемых микроорганизмов. Наконец, высокая численность в почве бактерий, продуцирующих антибиотики, делает почву важнейшим резервуаром генов, ответственных за устойчивость к антибиотикам. Данное направление напрямую связано со здоровьем человека, поэтому почвенная метагеномика может быть использована для решения многих задач при клинических исследованиях.

Рис. 1. Метагеном чернозема Каменной Степи (Воронежская обл.) на уровне субсистем генов. Рисунок предоставлен автором

В почвенно-экологических исследованиях более широкое распространение приобрели метагенетические исследования с использованием метабаркодинга за счет относительной простоты, сравнительно низкой цены и более высокой разрешающей способности. С помощью метагенетического подхода появилась возможность анализировать структуру и разнообразие сообщества грибов, водорослей, протистов и животных в почве. Микробные сообщества значительно различаются в зависимости от глубины и типа генетического горизонта почвы, кластеризуясь на сообщества A, AB и B горизонтов; различия по типу землепользования при этом оказываются значительно ниже (Рис. 2).

Изучение экологии новых труднокультивируемых таксонов – веррукомикробий и таумархеот – классический пример применения мета-подходов в почвенных исследованиях. До сих пор всего три вида таумархеот выделены в чистую культуру. С помощью молекулярно-генетических методов было показано, что таумархеоты являются самыми распространенными археями в почве и вообще на Земле, и, по всей видимости, являются основными окислителями аммония в почвах. По сравнению с нитрифицирующими бактериями, таумархеоты хорошо адаптированы к низким концентрациям аммония, что дает им преимущество в олиготрофных условиях среды, характерных для почв. Доля аммонийоксилящих архей в некоторых почвах может достигать 15-20% от всего сообщества. Подобно таумархеотам, подавляющее число видов веррукомикробий в настоящее время также не удалось выделить в чистую культуру. Тем не менее, метагенетический анализ показал, что данный филум является одним из основных доминантов в составе прокариотных сообществ почв, обычно варьируя в диапазоне от 5 до 15%, а в черноземах ‒ до 25% и выше.

Рис. 2. Схожесть структуры прокариотных сообществ A, AB и B горизонтов черноземов лесополосы, залежи и пашни по методу Брэя-Кертиса. Левый рисунок: красный – горизонты A, синий – АВ, желтый – В. Правый рисунок: красный – пашня, желтый – залежь, зеленый – лес. Рисунок предоставлен автором

Также метабаркодинг считается наиболее эффективным способом выявления «ключевых» таксонов, которые отличаются сравнительно высокой долей в составе сообщества, но определяют его структуру и имеют большое количество связей в межвидовых сетях. Сложность межвидовых сетей может служить экологическим индикатором функционирования и устойчивости микробных сообществ в почве, ризосфере и прочих почвенных микролокусах. На основе результатов метабаркодинга было показано, что межвидовые сети в ризосфере по сравнению с почвой менее сложны, но более устойчивы, а таксоны сильнее ассоциированы друг с другом. Сложность межвидовых сетей может быть использована при диагностике антропогенных нарушений. Во вторичных лесах после вырубки по сравнению с первичными происходит упрощение межвидовых сетей, а также замещение основных медиаторов внутри сетей. Интенсификация сельского хозяйства и применение традиционной системы земледелия на базе средств химизации нарушает структуру межвидовых сетей в почве, сокращает ее сложность, а также численность ключевых таксонов. Органическая система земледелия, наоборот, помогает восстанавливать сложность межвидовых сетей в почве.

Произведена попытка картографирования пространственного распределения почвенных микробных сообществ. Для этого были отобраны и проанализированы 2173 образцов почв на территории Франции. В результате были построены карты видового богатства, микробного разнообразия и распространения отдельных таксонов. Благодаря таким картам авторам удалось показать роль разных почвенно-экологических факторов в формировании структуры почвенных микробиомов, среди которых наиболее значимыми оказались pH, тип землепользования и гранулометрический состав.

Несмотря на обширный объем информации о биоразнообразии почв, полученный использованием метагеномики и метабаркодинга, на сегодняшний день существует недостаток микробиологических показателей плодородия и экологического состояния почв, необходимых для оценки и мониторинга почвенных ресурсов. Именно метагеномика и метабаркодинг считаются наиболее перспективными направлениями по выявлению таких показателей – биоразнообразия, численности индикаторных таксонов и сложности межвидовых связей.