Одноклеточные водоросли — перспективная платформа для производства противораковых иммунотоксинов

Рис. 1. Одноклеточная зеленая водоросль <i>Chlamydomonas reinhardtii.</i> Диаметр клетки примерно 10 мкм. Единственный зеленый хлоропласт занимает почти весь объем клетки

Рис. 1. Одноклеточная зеленая водоросль Chlamydomonas reinhardtii. Диаметр клетки примерно 10 мкм. Единственный зеленый хлоропласт занимает почти весь объем клетки. Рисунок с сайта Прикладных исследований в области ботаники в Германии

Одноклеточные водоросли могут стать экономически эффективной системой для производства противораковых иммунотоксинов. В отличие от других клеток эукариот, клетки водорослей быстро размножаются на дешевых питательных средах, а хлоропласты водорослей, в отличие от бактерий, способны не только синтезировать чужеродные белки, но и осуществлять сложные постсинтетические процессы, необходимые для активации белков. Гены, кодирующие чужеродный белок, встраивают в геном хлоропластов водорослей, после чего те начинают синтезировать белок иммунотоксина в больших количествах.

Традиционные химио- или радиотерапия, применяемые для лечения рака, обладают принципиальным недостатком. Они преимущественно убивают раковые клетки, но в той или иной мере подавляют и нормальные.

Известно, что многие клетки злокачественных опухолей или злокачественные клетки кровеносной системы имеют на поверхности специфические белки. Поэтому с помощью антител против этих белков можно доставлять поражающие агенты именно к этим клеткам, что сейчас активно используется в разработке специфичных противоопухолевых препаратов. Антитела (иммуноглобулины) являются важнейшим фактором иммунитета. Они распознают чужеродные для организма агенты — бактерии, вирусы, белки и др. Антитела могут инактивировать эти агенты просто путем связывания или запускать иммунный ответ, например систему комплемента — комплекса протеолитических ферментов.

Одним из путей исследований по адресному поражению раковых клеток является разработка методами генной инженерии иммунотоксинов — антител против белков, специфичных для этих клеток, с прикрепленным к антителам химическим или природным токсичным агентом. Антитело должно «узнать» раковую клетку, а токсичный агент — убить ее.

Идея высказана давно, но практическая реализация оказалась затруднительной из-за сложности задачи и отсутствия экономически эффективных технологий для изготовления таких весьма сложных комплексов. Так, рекомбинантный иммунотоксин — фрагмент антитела с присоединенным к нему токсином, — можно производить в клетках бактерий (в основном для этого используется кишечная палочка Esherichia coli; чтобы бактерии продуцировли чужеродные белки, в них вводят гены этих белков при помощи плазмид). Однако бактерии не могут осуществлять многие постсинтетические процессы, необходимые для обеспечения биологической активности белков эукариот: они неспособны формировать правильные дисульфидные связи, правильно укладывать синтезированные полипептидные цепи чужеродных белков, что необходимо для их активности (иначе белки не смогут выполнять свою функцию). Рекомбинантный иммунотоксин в клетках бактерий получается в виде неактивного нерастворимого агрегата. Чтобы этот белок активировать, приходится его выделять, денатурировать (снова его разворачивать) и укладывать белковые цепи искусственно.

В культурах клеток эукариот эта проблема формирования правильной трехмерной структуры чужеродного белка решается, но токсины будут отравлять клетки-продуценты (клетки, которые производят белок).

Тем не менее эти трудности, по крайней мере частично, удается преодолеть обходным путем, если исключить прямой контакт культуры клеток-продуцентов с токсином. Например, активные антитела против специфичного для некоторых лимфом (злокачественного перерождения лимфоцитов) белка клеточной мембраны CD30 изготовляют в культурах клеток млекопитающих — CHO-клетках хомячков (см. CHO cells). Их очищают и связывают с химическим соединением ауристатином Е (Monomethyl auristatin E), подавляющим деление эукариотических клеток. Показана высокая активность и избирательность действия этого препарата (Brentuximab vedotin) против злокачественных клеток. Он уже разрешен в США для применения в клинике по крайней мере против двух форм лимфомы. Однако, вследствие больших затрат на разработку, сложности и дороговизны производства, цена Brentuximab vedotin оказалась поистине астрономической: курс лечения будет стоить примерно 100 тысяч долларов.

Биотехнологи из Калифорнийского университета в Сан-Диего предлагают экономично решить проблему изготовления противораковых иммунотоксинов с помощью неприхотливых зеленых одноклеточных водорослей Chlamydomonas reinhardtii (рис. 1). Этот объект хорошо изучен и широко используется в различных теоретических и прикладных исследованиях. Например, C. reinhardtii в определенных условиях продуцирует водород, и рассматривается как возможный продуцент биотоплива. Уже определены нуклеотидные последовательности 17 хромосом ядерного генома этой водоросли, а также геномов митохондрий и хлоропласта (митохондрии и хлоропласты, возможно, были когда-то симбиотическими бактериями внутри первых клеток эукариот — так ученые объясняют наличие отдельного генома у этих органоидов, похожего больше на геном бактерий, чем на геном эукариот; см. Симбиогенез).

C. reinhardtii принадлежит к низшим эукариотам, и его ядерно-цитоплазматические механизмы для производства противораковых иммунотоксинов непригодны: токсин будет их подавлять. Но механизмы синтеза белков хлоропласта, который занимает примерно 70% объема клетки, устроены подобно бактериальным, по прокариотному типу, и токсины, губительные для эукариот, но не прокариот, на них не действуют. В то же время замечательной особенностью хлоропласта является то, что он, в отличие от бактерий, имеет все необходимые механизмы для сборки сложных белковых комплексов. Поэтому они, с одной стороны, нечувствительны к ряду белковых токсинов, летальных для клеток эукариот, а с другой стороны, могут продуцировать биологически активные иммунотоксины.

Рис. 2. Рекомбинантная структура для синтеза иммунотоксинов в хлоропластах C. reinhardtii

Рис. 2. Рекомбинантная структура для синтеза иммунотоксинов в хлоропластах C. reinhardtii. Ген иммунотоксина снабжен регуляторными элементами для экспрессии в хлоропластах. Он соединен с геном устойчивости к канамицину (aphA6), необходимым для отбора клеток, в которые встроилась рекомбинантная структура. Структура фланкирована (обрамлена) участками генома хлоропласта, за счет которых осуществляется интеграция в этот геном.
Обозначения: 5'UTR — некодирующая область на 5'-конце ДНК (перед началом гена); 3'UTR — некодирующая область на 3'-конце ДНК (после конца гена); psbA — ген хлоропластов, вместо которого вставили ген иммунотоксина (от гена psbA остались промотор — сигнал начала синтеза белка — и 3'UTR); atpA — ген хлоропластов, от которого в данной конструкции используется промотор; rbcL — хлоропластный ген большой субъединицы фермента рибулозобифосфат-карбоксилазы, 3'UTR которого используется в конструкции; 5S RNA и 23S RNA — гены рибосомных РНК. Рисунок из обсуждаемой статьи в PNAS

Авторы сконструировали рекомбинантную структуру (рис. 2), кодирующую пептидные цепи антитела, узнающего мембранный белок CD22 В-клеток лимфомы, связанные с доменами II и III белкового экзотоксина А синегнойной палочки Pseudomonas aeruginosa. Токсин подавляет работу рибосом (биосинтез белка) эукариотических клеток, но не рибосом клеток прокариот. Чтобы рекомбинантный белок-иммунотоксин (рис. 3) мог синтезироваться в хлоропластах при помощи этой конструкции, её снабдили необходимыми для этого элементами (специфическим промотором) и встроили в геном хлоропласта по механизму гомологичной рекомбинации (части конструкции были похожи на геном хлоропласта, что облегчало ее встраивание). Полученные штаммы C. reinhardtii продуцировали белки ожидаемого молекулярного веса с ферментативной активностью, свойственной экзотоксину А. В культурах клеток иммунотоксин эффективно подавлял лимфомные В-клетки, но не лейкемические Т-клетки, не имеющие белка CD22. И наконец, иммунотоксин блокировал рост опухолей у мышей, которым были введены лимфомные В-клетки человека.

Рис. 3. Структуры белков-иммунотоксинов, синтезированных в хлоропластах C. reinhardtii

Рис. 3. Структуры белков-иммунотоксинов, синтезированных в хлоропластах C. reinhardtii. А — фрагмент антитела (вариабельная область), узнающий белок CD22. В — иммунотоксин: фрагмент антитела, соединенный с биологически активными доменами II и III белкового экзотоксина А синегнойной палочки Pseudomonas aeruginosa. С — усовершенствованный иммунотоксин с повышенной активностью и устойчивостью: димер структуры В, в который дополнительно встроена константная область антитела. Рисунок из обсуждаемой статьи в PNAS

Разумеется, прежде чем полученные в хлоропластах иммунотоксины будут допущены в клиническую практику, требуется доказать их эффективность и отсутствие неприемлемых побочных эффектов. В частности, можно ожидать, что иммунотоксин будет поражать не только лимфомные В-клетки, но и нормальные В-лимфоциты. Однако уже проведенные испытания аналогичного препарата Brentuximab vedotin позволяют надеяться, что такой побочный эффект будет приемлемым.

Таким образом, хлоропласты водорослей представляются в высшей степени перспективными для производства противораковых иммунотоксинов. Бактерии не могут производить активные сложные белковые комплексы. Прямой синтез иммунотоксинов в культурах клеток млекопитающих невозможен, так как токсины отравляют эти клетки. Высшие растения, в хлоропластах (но не в цитоплазме) которых, в принципе, также можно производить иммунотоксины, растут медленее, и риск их неконтролируемого распространения гораздо выше. Напротив, C. reinhardtii и им подобные быстро размножаются, их культивируют в закрытых реакторах на дешевых средах — растворах простых минеральных солей, что ценно как с экономической точки зрения, так и для защиты окружающей среды. Таким образом, хлоропласты водорослей открывают новый путь для создания противораковых средств следующего поколения.

Источник: Miller Tran, Christina Van, Daniel J. Barrera, Pär L. Pettersson, Carlos D. Peinado, Jack Bui, and Stephen P. Mayfield. Production of unique immunotoxin cancer therapeutics in algal chloroplasts // Proc Natl Acad Sci USA. 2013. V. 110. Р. E15–22.

Вячеслав Калинин


5
Показать комментарии (5)
Свернуть комментарии (5)

  • dims  | 05.03.2013 | 21:34 Ответить
    Непонятно, если на раковых клетках антигены-таки есть, то что мешает сделать обычную вакцину? Вакцина стимулирует иммунитет, у которого уже есть все неоюходимые токсины для уничтожения клеток.
    Ответить
    • TaTsfa > dims | 06.03.2013 | 00:27 Ответить
      Вмешаюсь, как человек, имеющий некоторое отношение к изучению рака. :-) Да, существует целое направление в онкологической науке - создание противораковых вакцин. Вот, например, довольно-таки новый обзор на эту тему http://link.springer.com/article/10.1007%2Fs00005-011-0129-y.Кстати, в обзоре ставится вопрос по поводу перспективности данного направления. Как водится, идея проста, но реализовать её не так-то просто. Иначе наши иммунные клетки лучше б справлялись с раковыми опухолями (кстати, наша иммунная система в той или иной степени умеет бороться с раковыми клетками и их предшественниками, только вот, увы, не всегда выходит победительницей в этой борьбе).

      Кстати, антигены на раковых клетках - это очень часто белки, которые характерны для эмбриона, но не для взрослого человека. А в статье, которая обсуждается в этой новости вообще как антиген был взят белок, присутствующий на всех В клетках - как на раковых, так и на нормальных.
      Ответить
  • samara  | 07.03.2013 | 03:39 Ответить
    Снимаю шляпу перед авторами.. хотя нет, пред всеми кто занимается этой областью.
    Ответить
  • EnigMan  | 08.03.2013 | 16:34 Ответить
    У меня вопрос, наверно, технического плана. Белок синтезировался в хлоропласте и что, там остается, или выделяется в цитоплазму водоросли и отравляет ее, или же налажен транспорт из хлоропласта через цитоплазму во внешнюю среду?
    Ответить
  • Aab  | 11.03.2013 | 21:06 Ответить
    Ужас! 100 тысяч долларов курс. Ложись и помирай. Государство не даст таких денег. Мало того, я посмотрел, надо даже не 100 тысяч, а 180!

    Вот человек мучается: http://vk.com/club46619518

    Улита едет в правильном направлении, надеюсь, но: когда то будет?

    Интересно, насколько препараты, получаемые по такому методу окажутся дешевле? Что-то мне подсказывает, что всё равно сумма на курс круглая получится. Хорошо бы, чтоб раз в 10 хотябы меньше денег уходило; не верю, что ещё меньше по цене можно упасть.
    Ответить
Написать комментарий


Элементы

© 2005-2017 «Элементы»