Немецкие биотехнологи создали из ДНК искусственные ионные каналы

Молекула альфа-гемолизина

Молекула альфа-гемолизина — стрептококкового токсина — вдохновила биотехнологов на изготовление искусственного ионного канала. Изображение с сайта 3dmoleculardesigns.com

Ионные каналы — это один из главных инструментов, с помощью которых клетка обменивается веществом с внешним миром. Эти сложные молекулярные устройства, подобно вахтерам на КПП, одновременно и анализируют молекулы, и контролируют поток частиц через клеточную мембрану. Немецкие ученые, создатели искусственной версии такого канала, считают, что их аналог может выполнять обе функции. Пропускную способность определяют параметры ионных каналов (форма, диаметр, заряд проходящей сквозь канал молекулы), и эти параметры можно менять по желанию исследователей. Аналитические возможности искусственных каналов, как было подтверждено серией экспериментов, тоже сравнимы с естественными: они надежно различают полимерные молекулы по длине и конфигурации.

Как известно, в двуслойную липидную мембрану клетки встроены белковые комплексы, которые помимо прочего контролируют поток разных молекул внутрь клетки и наружу. Пропуском могут служить и специфические молекулы, распознаваемые поверхностными рецепторами, и размер, и конфигурация, и заряд молекул. Часть таких мембранных комплексов именуется ионными каналами, через них заряженные частицы отправляются наружу или внутрь клетки. Все процессы, которые зависят от разности потенциала на мембране, — а таких очень много — основаны на работе ионных каналов. Любое живое существо зависит от своих ионных каналов: без них невозможны прохождение нервных импульсов (одного этого достаточно!), мышечные сокращения, водный обмен и многое другое. Исследованию принципов их действия и их классификации по функциям и строению посвящена заметная область науки физиологии.

И вот теперь биотехнологи дошли до того, что спроектировали и сделали работающий искусственный ионный канал. Их привлекала идея смоделировать канал с предсказуемыми свойствами. Создателями версии искусственных ионных каналов стали немецкие ученые из Мюнхенского технического университета и Мичиганского университета в Анн Арборе (США). Они решили уподобить свое творение природному каналу альфа-гемолизину — белку-токсину, выделяемому стрептококками и стафилококками. Это один из наиболее изученных канальных комплексов, его строение расшифровали первым, и устроен он проще других.

Механизм работы альфа-гемолизина таков. Как известно, концентрации различных ионов внутри и снаружи клетки сильно отличаются. Например, ионов калия много внутри клетки и мало снаружи, а ионов натрия — наоборот, много снаружи и мало внутри. Из-за этого возникает разность потенциалов между внутренней и наружной поверхностями клеточной мембраны — мембранный потенциал (подробнее о нем рассказано в заметке Обнаружен еще один способ, с помощью которого нейроны контролируют свою возбудимость, «Элементы», 15.07.2010). На этот потенциал, как уже говорилось выше, «завязано» огромное количество происходящих в клетке процессов — например, с его помощью осуществляется транспорт через мембрану определенных веществ (см. симпорт). Поэтому наличие мембранного потенциала совершенно необходимо для жизни клетки.

И вот некоторые патогенные бактерии (например, стрептококки и стафилококки) научились пользоваться тем, что при нарушении мембранного потенциала клетка погибает. Оказавшись возле клетки, эти бактерии начинают выделять белки, которые собираются в ионный канал — гемолизин — на клеточной мембране. Этот канал, в отличие от «добропорядочных» каналов нормальной мембраны, пропускает не строго определенные ионы в строго определенный момент, а все ионы подряд и постоянно (то есть, по сути дела, это не канал, а просто «дырка», пора). В результате концентрации ионов по обе стороны мембраны выравниваются, мембранный потенциал исчезает и клетка погибает. Наиболее уязвимы для таких атак красные клетки крови, эритроциты, и, собственно, поэтому гемолизин (в переводе с греческого ‘растворяющий кровь’) и получил свое название.

Конечно, ученым канал нужен не для убийства клеток. Такой канал, подобно демону Максвелла, позволил бы отсортировывать на одной стороне мембраны только строго определенные молекулы. А уж использовать подобное свойство можно по-всякому.

Альфа-гемолизин состоит из семи (шести-восьми) белковых субъединиц, которые формируют полый бочонок. Этот бочонок прикрепляется к мембране гидрофобным донцем. К донцу присоединена трубка из остатков лизина и глутамата, она-то и проходит сквозь мембрану. Диаметр внутреннего отверстия трубки 2,2 нм, в самой узкой части прикрепления к донцу — около 1,5 нм. Примерно такую же по форме структуру, но только в основе своей из ДНК, смоделировали немецкие биотехнологи.

ДНК в данном случае оказалась очень удобной молекулой. Задав первичную структуру молекулы (то есть последовательность нуклеотидов), можно предсказать и вторичную и третичную ее структуру. Иными словами, получить молекулу заданной формы и размера.

В отличие от белков, для которых известно двадцать мономеров — аминокислот, — между которыми существуют сложные отношения (каждая возможная пара аминокислот может сильно или слабо притягиваться или отталкиваться в зависимости от заряда, растворимости в воде и жирах и так далее), ДНК образована всего четырьмя нуклеотидами, отношения между которыми просты: аденин соединяется с тимином, а гуанин — с цитозином. Поэтому создать из нескольких одноцепочечных отрезков ДНК пространственный комплекс с заданными свойствами легко — это всё равно что делать модели из спичек. Там, где «спички» (то есть отрезки ДНК) должны быть соединены, надо поставить «скрепки» — короткие олигонуклеотидные отрезки, комплементарные нужным участкам «спичек». При этом ДНК-«спички» куда интереснее в пространственном отношении, чем обычные деревянные спички: если их скрепить определенных образом, они могут изогнуться и сообщить итоговой трехмерной структуре еще более сложную форму. Конечно, всё не так просто, и надо всегда просчитывать структуру комплекса так, чтобы друг с другом не соединилось что-нибудь лишнее. Однако при правильном использовании данная методика (известная также как «ДНК-оригами»; см. DNA origami) позволяет создавать довольно сложные трехмерные комплексы с заданными свойствами.

И в данной работе это с успехом было проделано. Исследователи создали искусственный ДНК-оригамный канал (рис. 1), основные характеристики которого совпадали с таковыми для альфа-гемолизина: диаметр поры составлял 2 нм, длина около 47 нм, сила ионного потока 0,87 наносименса (об ионных токах через каналы рассказано в главе «Уравнение Нернста и поток ионов» в книге «Молекулярная биология клетки»). Канал сначала сам себя строил на мембране, а затем, укрепившись, начинал проводить ионный ток через мембрану. Ток через единичный канал, как и предполагалось, был более или менее постоянным.

Вот такой получился ионный канал

Рис. 1. Вот такой получился ионный канал. А — вид спереди и сбоку. B — поперечный срез канала на мембране. Красным цветом показан собственно трансмембранный канал; белые стержни — 54 домена двухцепочечной ДНК, упакованные в форме сот; к концам этих доменов прикреплены одноцепочечные нити, спаренные с холестерол-модифицированными олигонуклеотидами (оранжевые нити и стержни). Эти последние помогают бочонку из ДНК закрепиться на липидной мембране. C — усредненный вид канала сверху и сбоку в электронном трансмиссионном микроскопе. Изображение из обсуждаемой статьи в Science

Так же, как и клеточные ионные каналы, искусственные аналоги могли пропускать одноцепочечные ДНК с одной стороны мембраны на другую. При проходе молекулы ДНК через канал отверстие закрывается и ток блокируется. Поэтому о прохождении молекул через поры судят по характерной картине скачков силы тока: момент прохождения крупной молекулы через канал на развертке тока выглядит как локальный минимум. Чем больше на проходящей молекуле запутанных петель и прикрепленных остатков, тем дольше время блокировки тока и тем меньше времени канал открыт. Для каждого из исследованных видов молекул ученые зафиксировали свою специфическую картину прохождения через канал (рис. 2). Это значит, что с помощью искусственных ионных каналов можно анализировать молекулы в растворе.

Изменения прохождения тока через канал при различных условиях

Рис. 2. A — так меняется ток через канал, когда через него в одну или другую сторону проходит одноцепочечная ДНК с петлей на конце; видно, что различаются и время, и амплитуда блокад. B — здесь изображены изменения токов при прохождении свернутого нуклеотидного комплекса через канал: с коротким тимидиновым хвостом в 60 нуклеотидов (вверху) и длинным, в 125 нуклеотидов (внизу). Видно, что чем длиннее хвост, тем больше время блокады тока. Изображение из обсуждаемой статьи в Science

А если в структуру строительной ДНК внести небольшие изменения? Конечно, изменения должны быть такие, какие задумал исследователь, пожелавший получить другие пропускные способности канала. Действительно, моделируя петли в структуре строительных блоков ДНК, ученые получили каналы с заданными характеристиками (рис. 3).

Распределение времени, когда канал открыт

Рис. 3. Распределение времени, когда канал открыт. Красным цветом показан базовый вариант канала, серым цветом — вариант с внесенным изменением. Пропускное время канала зависит от естественных флуктуаций в строительных молекулах, от диаметра пор и от заряда разных его частей; видно, что для двух сконструированных каналов эта характеристика различается. Изображение из обсуждаемой статьи в Science

Ясно, что конструирование искусственных ионных каналов — это область будущих технологий. Предполагается, что подобные наноустройства станут не только перспективными молекулярными анализаторами, но и лекарственными агентами с широчайшей областью применений. Остается надеяться, что это будущее не очень отдаленное, здесь наука развивается прямо-таки c космической скоростью. Вот, например, забавная ремарка из статьи: «В прошлом было показано, что наноразмерные мембранные поры потенциально могут оказаться исключительно полезными мономолекулярными биосенсорами» (и далее несколько ссылок на литературу). Если судить по этим ссылкам, то «прошлым» авторы работы считают 2001–2010 гг. Прошлое стремительно уносится, но так же стремительно приближается будущее.

Источники:
1) Martin Langecker, Vera Arnaut, Thomas G. Martin, Jonathan List, Stephan Renner, Michael Mayer, Hendrik Dietz, Friedrich C. Simmel. Synthetic Lipid Membrane Channels Formed by Designed DNA Nanostructures // Science. 2012. V. 338. P. 932–936.
2) Michael S. Strano. Functional DNA Origami Devices // Science. 2012. V. 338. P. 890–891. (Популярный синопсис обсуждаемой статьи.)

Елена Наймарк


13
Показать комментарии (13)
Свернуть комментарии (13)

  • Rattus  | 26.11.2012 | 06:25 Ответить
    >Такой канал, подобно демону Максвелла, позволил бы отсортировывать на одной стороне мембраны только строго определенные молекулы.

    Вопиющая неточность: каналы реализуют только пассивный перенос ПО градиенту концентрации. ПРОТИВ градиента работают _насосы_. Естественно с затратой свободной энергии из АТФ.
    Ответить
    • VerBa > Rattus | 26.11.2012 | 21:56 Ответить
      Нет, ну а если канал будет пропускать только катионы, но не анионы? Или будет такой узкий, что через него смогут протиснуться только маленькие ионы, а большие не смогут? Это же тоже сортировка.
      Ответить
      • Rattus > VerBa | 27.11.2012 | 05:17 Ответить
        Пфф, любой клапан пропускает частицы чего-нибудь в одну сторону, но для _нагнетания_ этих частиц в каком-то направлении одного клапана никак не достаточно. И броуновское движение тут не поможет никак - оно с обратной стороны будет мешать ровно так же, как с этой помогает.
        Это, помойму, очевидно же.
        Ответить
        • VerBa > Rattus | 27.11.2012 | 08:52 Ответить
          А где там сказано про нагнетание? Речь о сортировке - а сортировать ионы с помощью канала вполне себе можно (ну, может, с не очень высокой эффективностью).
          *Прошу прощения у Лены, что ответила в ее новости, не дождавшись ее ответа:)
          Ответить
          • Rattus > VerBa | 27.11.2012 | 11:08 Ответить
            Смысл в сортировке, если отсортированное не пропихнуть куда надо?
            Демон Максвелла еще и пропихивать должен был по идее же.
            Причем это-то как раз и не возможно без затрат свободной энергии.
            Ответить
            • VerBa > Rattus | 27.11.2012 | 22:59 Ответить
              Rattus, я не совсем понимаю, что Вы имеете в виду? Что, куда и зачем нужно пропихивать?
              Ответить
              • Rattus > VerBa | 28.11.2012 | 00:26 Ответить
                Классический демон Максвелла должен был сепарировать частицы с разными скоростями по разные стороны перегородки, при этом перемещаться на ту сторону они должны сами только за счет броуновского движения своего. II начало ТД показывает, что статистически это все же никак не возможно без затрат свободной энергии.
                Кроме того, я что-то не припомню в природных мембранах ионных каналов, селективных по направлению (с клапанами). А ведь это же, казалось бы, должно быть так эффективно? Сомнительно, что они не могли появиться эволюционно.
                Причем даже работа ионных насосов обратима (они тогда работают как ионные генераторы АТФ) - также как и работа любого фермента - поскольку любой катализатор в равной мере катализирует как прямую, так и обратную реакцию. А нужное направление конкретных реакций определяется только за счет своевременного удаления продуктов дальше по общему бмохимическому "конвееру".
                Ответить
                • VerBa > Rattus | 28.11.2012 | 00:59 Ответить
                  Я подозреваю, что Лена имела в виду "приблизительного", а не классического демона Максвелла.
                  Что же касается каналов, которые работают в одну сторону, - так большинство обычных каналов и без того так работает. С одной-то стороны концентрация ионов несравнимо выше, и ионы бурным потоком мчатся туда, где их мало. До того момента, как концентрация выровняется, в обратную сторону ничего по этому каналу не протиснется.
                  Ответить
                  • Rattus > VerBa | 28.11.2012 | 03:59 Ответить
                    Именно что при наличии насосов и при регулируемых каналах в клапанах смысла нет.
                    Ответить
                    • aa > Rattus | 28.11.2012 | 11:35 Ответить
                      Хоть я и не биофизик, но мое мнение такое: возьмем сосуд, который разделен перегородкой с очень малыми порами. С одной стороны сосуда находится какая либо жидкость из "больших молекул" (больше молекул воды), а с другой стороны у нас обычная вода. Если каналы в мембране очень малы (так, что они пропускают только молекулы воды),то у нас через время возникнет "осмотическое давление", известное еще со школы.
                      Ответить
                • Forest Snail > Rattus | 28.11.2012 | 13:04 Ответить
                  ---Причем даже работа ионных насосов обратима (они тогда работают как ионные генераторы АТФ) - также как и работа любого фермента - поскольку любой катализатор в равной мере катализирует как прямую, так и обратную реакцию. А нужное направление конкретных реакций определяется только за счет своевременного удаления продуктов дальше по общему бмохимическому "конвееру"---
                  Это не совсем верно. Если реакция необратима, как это часто бывает при использовании АТФ, то фермент не работает в обратную сторону.
                  Ответить
    • aa > Rattus | 28.11.2012 | 11:45 Ответить
      Что-то припоминаю, что есть "активный перенос" и "пассивный перенос". Осмотическое давление (перенос "против градиента давления") создается при особой структуре "каналов" и для его проявления нужны "особый начальные условия" - например, чтоб две принципиально разные жидкости были разделены "перегородкой" (или мембраной). Для "активного переноса" не нужно особых "начальных условий" и они работают "против градиентов", затрачивая энергию. Т.е., если бы у нас по обеи стороны мембраны были "одинаковые расстворы", то при "активном переносе" через время расстворы стали бы разными. При "пассивном переносе" в этом случае ничего бы не произошло (и осмотическое давление не появилось ). Помилуй нас, Господи!
      Ответить
  • eqlipt  | 28.11.2012 | 13:52 Ответить
    Рис. 1., B - срез похож на продольный, а не поперечный, как указано
    Ответить
Написать комментарий


Элементы

© 2005-2017 «Элементы»