Раскрыты молекулярные основы долговременной памяти

Нейрон

Рис. 1. Нейрон. Синаптическая область выделена и дана в увеличенном виде. Изображение с сайта en.wikipedia.org

У человека и животных известны кратковременная и долговременная память. Кратковременная память связана с фосфорилированием ряда белков в нейронах в ответ на их стимуляцию, что приводит к изменению «силы» синапсов. По мере того как модифицированные белки выводятся из оборота, событие забывается, если только не фиксируется в долговременной памяти. Очевидно, что механизм долговременной памяти принципиально отличен и должен базироваться на изменении, способном сохраняться очень долго. Но каком? Несколько лет назад было предположено, что таким изменением является переход в амилоидное состояние белка CPEB (Orb2 у мушки дрозофилы). И вот, наконец, эта гипотеза получила убедительное подтверждение. Американские биологи показали, что стимуляция нейронов у дрозофилы приводит к амилоидной олигомеризации белка Orb2, а мутации, нарушающие его олигомеризацию, также нарушают и долговременную память.

В этой работе соединились две большие области исследований: механизмы памяти и амилоиды. Предыстория открытия интересна и содержит немало важных деталей.

Амилоиды (см. amyloid) известны в первую очередь как патологические белковые структуры, вызывающие обширную группу амилоидных заболеваний, в частности болезни Альцгеймера и Паркинсона, а также прионные болезни. Они представляют собой фибриллярные полимеры некоторых в норме растворимых клеточных белков. Амилоиды катализируют структурную перестройку и присоединение к себе мономеров того же белка, и за счет этого растут. Они намного прочнее штатных клеточных полимеров, составляющих цитоскелет, поскольку фактически представляют собой единый мультимолекулярный бета-слой, в котором отдельные молекулы соединены множеством водородных связей. Поэтому амилоиды обладают высокой устойчивостью к протеазам и накапливаются, вызывая болезнь.

Амилоиды могут быть инфекционными, и тогда они называются прионами. У человека и животных прионы связаны лишь с одним белком, PrP, и вызывают коровье бешенство, скрейпи овец и болезнь Крейцфельдта–Якоба у людей. Инфекционность прионов связана с общим свойством амилоидов катализировать структурную перестройку. Различие же с прочими амилоидами по инфекционности определяется частными деталями: расположением прионного белка PrP на внешней клеточной мембране и, вероятно, какими-то механизмами, дробящими полимеры PrP на множество мелких, более подвижных частиц.

Явление, аналогичное прионам, было обнаружено у дрожжей Saccharomyces cerevisiae. У дрожжей, однако, прионы проявляются не как болезнь, а как фенотипы с нестандартным, неменделевским способом наследования. Прионы дрожжей (см. fungal prions) возникают спонтанно, но достаточно редко. Затем они могут стабильно сохраняться в ряду поколений, а при скрещивании и мейотической сегрегации передаваться всем потомкам. Таким образом, прионогенный белок может стабильно находиться в двух состояниях: прионном (полимеризующемся) или нормальном. А значит, клетку с прионогенным белком можно представить, как однобитную ячейку памяти.

А теперь перейдем к устройству памяти. Большая доля знания о работе нейронов была получена при изучении нейронов моллюска Aplysia californica. Этот крупный моллюск имеет большие и удобные для изучения нейроны. Ключевым механизмом памяти считается способность нейронов изменять силу своих синапсов, или синаптическая пластичность. Существует два вида памяти — кратковременная и долговременная. Кратковременная память опосредуется фосфорилированием некоторых уже существующих белков и укреплением имеющихся синаптических связей. Долговременная требует синтеза новых мРНК и белков и часто сопровождается установлением новых синаптических связей. Поскольку синтез мРНК происходит в ядре и затрагивает весь нейрон, возник вопрос: происходит ли событие запоминания одновременно во всех синапсах нейрона или же оно специфично для каждого синапса? На модели изолированного нейрона было показано, что единичный импульс нейромедиатора серотонина вызывает кратковременное синапс-специфическое запоминание, а два и более — долговременное. При этом, если первый импульс прикладывали к одному синапсу, а второй — к другому, то долговременное запоминание происходило во втором синапсе и только в нём.

Это позволило предположить, что первый импульс активировал транскрипцию мРНК, необходимых для запоминания, которые отправлялись во все синапсы, но были неактивными, «спящими». Второй импульс активировал эти мРНК в отдельно взятом синапсе. В поиске такого активатора Нобелевский лауреат Эрик Кандель с сотрудниками обратили внимание на белок CPEB (cytoplasmic polyadenylation element binding protein; не путать с транскрипционным фактором CREB), который активирует спящие мРНК в разных типах клеток. Активация происходит вследствие удлинения полиаденинового хвоста (см. polyadenylation), сигналом для чего служит связывание CPEB с последовательностью СРЕ в 3' нетранслируемой части мРНК.

И действительно, оказалось, что CPEB необходим для долговременной, но не кратковременной памяти, и его синтез намного увеличивается при стимуляции нейрона нейромедиатором серотонином. Далее обнаружилась удивительная вещь: по своей структуре CPEB оказался похож на дрожжевые прионные белки. Эти белки довольно несхожи между собой, но каждый из них имеет две части: функциональный домен и прионный домен, способный полимеризоваться. Функциональные домены совершенно различны, а прионные обладают общим свойством: они не структурированы и сильно обогащены аминокислотными остатками глутамином и аспарагином. Это свойство позволяет прионным доменам полимеризоваться в амилоидные фибриллы, и именно такой домен был обнаружен в белке CPEB. Свойства CPEB проверили в дрожжевой модели, и оказалось, что он ведет себя, как полноценный дрожжевой прион, то есть может переходить в стабильно наследуемое полимерное состояние. Правда, в отличие от дрожжевых белков, у которых прионное состояние функционально неактивно, у CPEB прионное состояние отличалось повышенной активностью. Всё это позволило предположить, что переход CPEB в полимерное состояние является ключевым событием в формировании долговременной памяти.

Однако доказательство этого тезиса оказалось нелегким, и, несмотря на интенсивные усилия, следующее продвижение в этой теме произошло лишь через семь лет. Видимо, это говорит о том, насколько сложнее манипулировать нервными клетками аплизии в сравнении с клетками дрожжей: трудно набрать достаточное количество клеток для биохимического анализа, сложнее манипуляции с генами. На этом этапе в тело нейрона аплизии инъецировали гены, кодирующие различные гибриды белка CPEB, сшитые с зеленым флуоресцентным белком. Такие гибриды — классический инструмент в изучении прионов: если белок растворим, клетка светится равномерно, а если он перешел в амилоидное состояние — свечение концентрируется в яркие точки. Гибридные белки, синтезированные нейроном, образовали характерные зеленые точки, а контрольный белок без глутамин-богатого домена давал диффузное свечение. Амилоидное состояние СРЕВ-GFP в точках было подтверждено окрашиванием амилоид-специфичным флуоресцентным красителем тиофлавином S. Также было показано, что переход СРЕВ-GFP в амилоидное состояние усиливался при стимуляции нервных клеток нейромедиатором серотонином. Прогресс небольшой, да и получен он был при искусственно завышенном уровне синтеза СРЕВ.

Структура кодирующей Orb2 мРНК и двух белков Orb

Рис. 2. Структура кодирующей Orb2 мРНК и двух белков Orb. Изображение из обсуждаемой статьи Amitabha Majumdar et al. в Cell, с изменениями

Но недавняя работа, сделанная уже на дрозофиле, расставила все точки над i. В отличие от аплизии, у дрозофилы есть два варианта белка СРЕВ: Orb2A и Orb2B, которые получаются из одной мРНК в результате альтернативного сплайсинга. Orb2B синтезируется постоянно (конститутивно), а Orb2A — лишь в ответ на стимуляцию нейрона. Они одинаковы в карбокси-концевой части, содержащей глутамин-богатый прионо-подобный домен и РНК-связывающий домен, но отличаются в амино-концевой части, имеющей 8 аминокислот в Orb2A и 162 аминокислоты в Orb2B (рис. 2). Было показано, что оба белка способны полимеризоваться, однако Orb2B может стабильно пребывать в растворимом состоянии, а Orb2A, напротив, с высокой вероятностью начинает полимеризацию. В частности, это наблюдали при флуоресцентной микроскопии гибридных белков Orb2-GFP (рис. 3). Оказалось, что способность Orb2A начинать полимеризацию связана с его уникальным N‑концевым фрагментом из 8 аминокислот.

Orb2A-GFP самопроизвольно полимеризуется, а Orb2B-GFP - нет

Рис. 3. При экспрессии в нейроне Orb2A-GFP образует амилоидные полимеры, видные как яркие точки, а Orb2B-GFP не полимеризуется, давая диффузное свечение. Длина масштабной линейки 10 мкм. Изображение из обсуждаемой статьи Amitabha Majumdar et al. в Cell, с изменениями

Эти наблюдения позволили предложить простую схему: при стимуляции синапса синтезируется Orb2A, он переходит в полимерное состояние и увлекает за собой Orb2B. Далее процесс полимеризации поддерживается молекулами Orb2B и может продолжаться сколь угодно долго, что соответствует фиксации события в долговременной памяти.

Для подтверждения этой модели провели мутагенез Orb2A и получили мутации, нарушающие его способность инициировать полимеризацию. Половина мутаций попала в уникальный N‑концевой фрагмент Orb2A, содержащий лишь 8 аминокислот. Наиболее эффективная из этих мутаций была изучена подробнее. Это оказалась замена в пятой позиции фенилаланина на тирозин.

У мушек с этой мутацией нормально работала кратковременная память, а вот долговременная была нарушена. Это выяснили в следующих тестах. Мушкам давали попробовать капельки воды, простой или с сахаром, помеченные разными запахами. Затем проверяли, в течение какого времени мушки смогут выбирать правильную каплю по запаху. У мутантов ассоциация сохранялась лишь в течение двух суток. В другом тесте самцу предъявляли несколько раз подряд «неотзывчивую» самку, уже прошедшую спаривание. Наученный таким горьким опытом, обычный самец навсегда разуверивался в женском поле и не начинал ухаживаний, встречая очередную самку. А мутантный самец забывал о своих романтических неудачах примерно через двое суток. Эти тесты показывают, что мутация, нарушающая полимеризацию Orb2, нарушает и долговременную память.

Таким образом, нервным клеткам удалось «приручить» амилоиды — элементы, которые ассоциируются в основном с болезнями. Кстати, в статье, а также в комментариях к ней полимер Orb2 часто называют прионом. Это неверно, он амилоид неинфекционный. Полимеризация Orb2 не передается не только другим нейронам, но даже, вероятно, и между синапсами одного нейрона.

Важным достижением данной работы является и то, что она впервые показала, как клетка может управлять переходом в амилоидное состояние. Однако существование механизма, способного вывести синапс из этого состояния, представляется маловероятным. Скорее всего, в компьютерной терминологии, мозг является устройством с однократной записью, подобным CD, а не винчестеру.

Несомненно, эта работа устанавливает один из принципов устройства живых организмов. Однако она заслуживает не только похвал. На всякого мудреца довольно простоты, и в этой работе есть существенный прокол. Он не отменяет главного вывода, хотя и ослабляет его и бросает плотную тень на научно-издательский процесс. Мы привыкли думать, что наиболее авторитетные научные журналы, к которым относится Cell, не могут публиковать откровенных ошибок. Ан нет. Среди представленных доказательств существенную роль имеет подтверждение существования полимеров СРЕВ методом электрофореза, выполненным совершенно некорректно. Авторы тщательно кипятят образцы в присутствии детергента, а в этих условиях любой амилоид должен раствориться. Удивительным образом растворяется не совсем всё, но всё равно такое безграмотное и неколичественное использование столь сильных средств недопустимо. В частной переписке авторы признали этот просчет. А ведь двумя годами раньше у них была еще одна статья в Cell с той же ошибкой. И это один из лучших и самых строгих журналов!

Как бы то ни было, но теперь мы понимаем основу устройства памяти. Интересно, для чего еще могут быть использованы амилоиды? Есть мнение, что это может быть процесс клеточной дифференциации.

Источники:
1) Kausik Si, Maurizio Giustetto, Amit Etkin, Ruby Hsu, Agnieszka M. Janisiewicz, Maria Conchetta Miniaci, Joung-Hun Kim, Huixiang Zhu and Eric R. Kandel. A Neuronal Isoform of CPEB Regulates Local Protein Synthesis and Stabilizes Synapse-Specific Long-Term Facilitation in Aplysia (PDF, 411 КБ) // Cell. V. 115. Issue 7. Pp. 893–904. 26 December 2003.
2) Kausik Si, Susan Lindquist and Eric R. Kandel. A neuronal isoform of the aplysia CPEB has prion-like properties // Cell. V. 115. Issue 7. Pp. 879–891. 26 December 2003.
3) Kausik Si, Yun-Beom Choi, Erica White-Grindley, Amitabha Majumdar, Eric R. Kandel. Aplysia CPEB can form prion-like multimers in sensory neurons that contribute to long-term facilitation // Cell. V. 140. Issue 3. Pp. 421–435. 5 February 2010. На сайте Sciencedirect статья находится в свободном доступе.
4) Amitabha Majumdar, Wanda Colón Cesario, Erica White-Grindley, Huoqing Jiang, Fengzhen Ren, Mohammed «Repon» Khan, Liying Li, Edward Man-Lik Choi, Kasthuri Kannan, Fengli Guo, Jay Unruh, Brian Slaughter, Kausik Si. Critical Role of Amyloid-like Oligomers of Drosophila Orb2 in the Persistence of Memory // Cell. V. 148. Issue 3. Pp. 515–529. 26 January 2012.

Виталий Кушниров


13
Показать комментарии (13)
Свернуть комментарии (13)

  • lesnik  | 12.03.2012 | 14:49 Ответить
    Т.е. выяснили, что необходимым условием закрепления памяти является образование амилоида в синапсе. А как такая информация считывается? Это как-то влияет на проводимость синапса?
    Ответить
    • vkushnirov > lesnik | 14.03.2012 | 22:29 Ответить
      СРЕВ в амилоидной форме активирует некоторое количество наименований спящих мРНК, в результате чего изменяются свойства синапса, он становится "сильнее", т.е. следующему нейрону передается более сильный сигнал, выбрасывается больше нейромедиатора. А сила синапса и есть элементарная единица хранимой информации. Запоминание новой информации сводится к двум типам событий: образованию новых межнейронных связей и/или увеличению силы уже существующих синапсов. В работе изучали второе событие, но, вероятно, СРЕВ участвует и в первом. Но не буду фантазировать, авторы не дают общую картину, а лишь изучают частную деталь.
      Сила синапсов определяет то, как воспримет сигнал следующий нейрон, возбудится или нет, пойдет сигнал дальше по сети или нет. А вот как отдельные нервные импульсы складываются в образы, мысли и решения - не знаю, да и не уверен, что это известно.
      Ответить
  • Alex  | 13.03.2012 | 00:52 Ответить
    Наверное память предполагает не только (а м.б. не столько) установление и закрепление связей между определенными нейронами, но и наличие некоего дирижера который проигрывает во времени прохождение возбуждений по данным связям. При этом мозг может неоднократно проигрывать во времени записанные концерты в форме воспоминаний, иногда теряя отдельные моменты, иногда начиная восполнять их новыми фантазиями. Что отвечает за последовательность и детали воспроизведения данных сценариев и где они хранятся? Буду благодарен за ссылки в относительно популярном изложении для не специалиста. Каким образом формируется, где хранится и как передается по наследству фильмотека врожденных инстинктов (приобретенных навыков) от поколения к поколению?
    Ответить
  • Alex  | 13.03.2012 | 01:52 Ответить
    Отдельный вопрос касается возможности "вспомнить" человеком чего-либо им самим непосредственно не пережитого. Например, иностранных языков, каких он лично никогда не изучал. Видел, правда по телевизору, интервью с бывшим солдатом, который пережил контузию в Афганистане и теперь говорит на многих языках, которых он никогда не изучал. Неужели это правда? Есть ли еще что-то подобное? Сам был знаком с близнецами, которым снились одинаковые сны.
    Ответить
    • VerBa > Alex | 13.03.2012 | 02:55 Ответить
      Вилли Мельников все-таки изучал языки, просто они давались ему намного легче, чем другим людям. Можно сказать, у него была счастливая контузия (если такие вообще бывают), которая не нарушила работу центра речи, а наоборот, заставила его работать интенсивнее. К памяти это имеет довольно косвенное отношение.
      Ответить
  • Kostja  | 13.03.2012 | 11:55 Ответить
    Важное исследование, трудно переоценить.
    Ответить
  • bsivko  | 29.03.2012 | 12:02 Ответить
    Комментарий от Бориса Ржабека:

    "Работа очень интересна. Но она далеко не исчерпывает проблем молекулярной основы памяти. Авторам явно неизвестна наша работа ( О поведении механорецепторного нейрона в условиях замыкания его цепью искусственной обратной связи.. ДАН СССР, 1971, т. 196, ¹4. С. 981-984 ) в которой была чётко показана возможность запоминания и обучения в одиночном нейроне ЛИШЕННОМ СИНАПСОВ вообще. Но это не единственый случай. когда принципиально важные работы. сделанные в России и СССР не известны зарубежным авторам."
    Ответить
    • Nashev > bsivko | 16.04.2012 | 16:54 Ответить
      Обратная связь без синапса? С его имитацией, наверняка… Синапс ведь и есть точка контакта на конце связи…
      Ответить
  • Бруней  | 29.03.2012 | 17:21 Ответить
    Чудесная статья!
    Только одно маленькое сомнение. "Наученный таким горьким опытом, обычный самец навсегда разуверивался в женском поле" - вот это сомнительно (зачем такой механизм самцу дрозофилы?) и вроде бы это не следует из статьи. Там речь идёт о нескольких днях (больше трёх).
    Ответить
    • vkushnirov > Бруней | 31.03.2012 | 23:38 Ответить
      Да, немного странновато. Только это, видимо, стандартный тест в данной области науки, и, значит, явление имеет место быть.
      Ответить
  • Microcin  | 25.05.2012 | 01:05 Ответить
    оч интересно, только честно говоря, не очень верится, что память устроена "как CD". Не то чтобы я представлял, как можно разобрать амилоид, но наши воспоминания явно динамичны, т.е. меняются при их "воспроизведении" от года к году. Думаю, пока это только кусочек общей картины
    Ответить
  • Microcin  | 25.05.2012 | 01:21 Ответить
    В каком месте методический просчет я тоже не понял, они изучают амилоид, который устойчив к кипячению в SDSе.
    Ответить
  • Странник  | 21.06.2012 | 14:20 Ответить
    Мне совершенно не ясно, как связано накопление амилойда с памятью. Какие образом такая реакция способно помочь запомнить совершенно различную информацию? Если это один бит информации, то сколько же синапсов должно уходить на запоминания одного события. Скажем свадьбы или рождения ребёнка. Не говоря уже о курсе высшей математики. Нейронов много, синапсов ещё больше, но всё же... Ведь нужно ещё где-то хранить "управляющую информацию" о том, где какая информация хранится.
    Ответить
Написать комментарий


Элементы

© 2005-2017 «Элементы»