Уточнен механизм, по которому развиваются конечности у куриного эмбриона

Рис. 1. A. Свежедиссоциированные клетки (первый контроль), образуют все три сегмента конечности через 14 дней после трансплантации. Изображение из обсуждаемой статьи K. L. Cooper et al.<
Рис. 1. A. Свежедиссоциированные клетки (первый контроль), образуют все три сегмента конечности через 14 дней после трансплантации. B. Клетки, которые 36 часов культивировали в Wnt3a, FGF8 и ретиноевой кислоте (WFR), способны сформировать все три сегмента конечности, хотя проксимальный сегмент этой конечности удлинен по сравнению с нормальным, а средний — наоборот, укорочен. На Е показана фотография этой конечности, а на F, G и H — фотографии ее участков, из которых видно, что проксимальный и средний сегменты покрыты перьями, а дистальный — чешуйками. Тип покрытия свидетельствует об истинной «проксимальности» и «дистальности» сегментов. C. Клетки, которые 36 часов культивировали только в Wnt3a и FGF8 (WF) без ретиноевой кислоты (второй контроль), могут сформировать только один палец, «сидящий» на хрящевом узелке. На D видно, что палец этот покрыт чешуйками, как и положено самому дистальному сегменту (иными словами, это не недоразвитый проксимальный участок). F — femur, бедро; T/F — tibia and fibula, большая и малая берцовые кости; M — metatarsal, плюсна; D — digits, пальцы. Длина масштабной линейки 5 мм в A и E, 2,5 мм в B и C, 1,6 мм в D и 1 мм в F–H. Изображение из обсуждаемой статьи K. L. Cooper et al.

Куриный эмбрион, пожалуй, самая любимая модель у эмбриологов и биологов развития. Тем не менее даже для столь досконально изученного организма существует множество загадок и белых пятен. Например, в течение десятков лет не было до конца понятно, каким именно способом регулируется развитие конечностей (см. Limb development) куриного эмбриона. И вот, кажется, сейчас эта проблема наконец разрешена — в недавнем номере Science вышло две статьи, убедительно показывающих, что правильное развитие конечностей у цыплят по проксимально-дистальной оси управляется с помощью градиентов двух веществ, одно из которых имеет наибольшую концентрацию в основании конечности, а другое — возле ее кончика.

Об общих принципах, по которым одна-единственная оплодотворенная клетка превращается в сложное высокоорганизованное существо, уже замечательно рассказал Александр Марков (Как клетки понимают, что одни должны стать волосами, другие костями, третьи мозгами и т. п.? — «Элементы», «Детские вопросы»). Теперь же речь пойдет о более конкретной проблеме, а именно о правильном развитии конечностей по проксимально-дистальной оси. Как так получается, что проксимальные (то есть расположенные ближе к туловищу) и дистальные (то есть, наоборот, более удаленные от туловища) участки конечности не перепутываются в процессе развития? Почему пальцы вырастают у нас на кисти, а не на плече; как получается, что у нас на каждой ноге только одна ляжка, а не несколько штук, соединенных в цепочку? Каковы механизмы, по которым участки конечности выстраиваются вдоль проксимально-дистальной оси в нужном порядке? Эти вопросы уже много лет волнуют умы ученых, занимающихся биологией развития.

Почти тридцать лет назад, в 1973 году, английский биолог развития Льюис Вольперт (ему принадлежит афоризм «Главное событие вашей жизни — это не рождение, свадьба или смерть. Это гаструляция.») и его сотрудники выдвинули изящную теорию образования конечностей у куриного эмбриона. По ней, в клетках развивающейся конечности работает что-то вроде автономных часов, которые «считают» клеточные деления и в зависимости от того, сколько прошло этих делений, запускают образование того или иного участка конечности из недифференцированных клеток. При этом проксимальные участки образуются первыми, и чем больше прошло времени, тем дистальнее будут возникающие структуры.

Казалось бы, гипотеза эта (она получила название «модель прогрессивной зоны») достаточно простая и легко проверяемая — однако не тут-то было. В течение последующих десятилетий исследователям не удалось ни подтвердить, ни опровергнуть это предположение. Зато возникло несколько других гипотез — и одна из них постулировала, что никакие внутренние часы для верного развития конечности не нужны, а нужен правильный градиент некоторых веществ вдоль проксимально-дистальной оси, причем одни из этих веществ имеют наибольшую концентрацию со стороны основания конечности, а другие — со стороны ее кончика.

У каждой теории были косвенные подтверждения и ярые сторонники в научном мире, но прямых доказательств верности ни у одной из них не было.

И вот наконец-то две группы ученых — одна смешанная американо-голландско-испанская, другая испанская — убедительно показали, что модель прогрессивной зоны неверна, внутренних часов у развивающихся конечностей нет, а регулируется их образование градиентами определенных веществ вдоль проксимально-дистальной оси.

Вообще, в управлении развитием конечностей уже давно были заподозрены ретиноевая кислота (см. Retinoic acid), которая влияет на растущую конечность с проксимального конца, и факторы роста фибробластов (см. FGF), которые, наоборот, действуют дистально. Самый простой способ проверить, верны ли эти подозрения, — просто «выключить» данные вещества с помощью блокаторов и посмотреть, как будет развиваться конечность. Но, к сожалению, это невозможно, поскольку в результате прекращается развитие конечностей как таковых.

Однако данную проблему можно обойти, если использовать недавно разработанную методику, которая позволяет сохранить клетки почки конечности (участки, из которых у эмбриона развиваются конечности, см. limb bud) в культуре в недифференцированном и пролиферирующем состоянии. Для этого необходимо выдерживать их в среде с белком FGF8 — одним из членов FGF-семейства — и белком Wnt3a, который также вовлечен в регуляцию эмбриональных процессов (см. Wnt signaling pathway).

При наличии этой методики достаточно добавить к культивируемым клеткам исследуемые вещества, а потом собрать из них так называемую «рекомбинантную конечность», трансплантировать ее в развивающийся эмбрион и посмотреть, какая в результате вырастет конечность и чем она будет отличаться от нормальной.

Итак, исследователи из первой — американо-голландско-испанской — группы создали три варианта рекомбинантных конечностей:

    1) та, клетки которой вообще не держали в культуре, а сразу, едва диссоциировав, собрали из них рекомбинантную конечность (первый контроль);

    2) та, на клетки которой НЕ действовали ретиноевой кислотой, а просто содержали 36 часов в культуре (второй контроль);

    3) та, на клетки которой в культуре действовали ретиноевой кислотой в течение 36 часов (опыт).

Результаты данного эксперимента показаны на рис. 1. Видно, что хотя «ретиноевая» конечность не совершенно безупречна (например, у нее нарушены соотношения размеров сегментов), но в ней, по крайней мере, развиты все три сегмента, в то время как при отсутствии ретиноевой кислоты вместо полноценной конечности развивается всего один палец.

Этот эксперимент явно свидетельствовал о «проксимализующей» роли ретиноевой кислоты, а кроме того, наносил сокрушительный удар по модели прогрессивной зоны. Ведь если в клетках развивающейся конечности работают автономные часы, то при содержании в культуре они должны отсчитывать прошедшие деления и, после трансплантации в эмбрион, запустить образование сразу дистальных структур. Но если под влиянием ретиноевой кислоты в конечности всё же развиваются проксимальные сегменты, это означает, что автономных часов в клетках нет, и развитие конечности определяется градиентом веществ вдоль проксимо-дистальной оси, а отнюдь не прошедшим с начала ее образования временем. Кроме того, в данном эксперименте выработана методика сохранения в культуре клеток, которые могут дать начало почти полноценной новой конечности, что открывает огромные возможности для дальнейших исследований.

Итак, как же развивается конечность? Вначале, еще в почке, ее клетки находятся под влиянием сразу двух веществ — ретиноевой кислоты и факторов роста фибробластов (последние, как уже было здесь замечено, среди прочих своих свойств обладают способностью сохранять клетки в недифференцированном состоянии). Ретиноевой кислоты больше в основании почки, а факторов роста фибробластов — в кончике, и поэтому клетки основания могут дифференцироваться и образуют под воздействием ретиноевой кислоты проксимальные структуры. Клетки растут и дифференцируются, конечность удлиняется, и вот расположенные на ее кончике клетки уже сильно удалены от источника ретиноевой кислоты. «Проксимализующее» влияние ретиноевой кислоты затухает, и клетки начинают образовывать всё более дистальные структуры.

Хорошо, но какова же тогда роль FGF? Позволяют ли эти белки образоваться дистальным структурам при отсутствии влияния ретиноевой кислоты — или заставляют их образоваться, каким-то образом на них влияя? Судя по всему, всё-таки заставляют — по крайней мере, об этом свидетельствуют результаты экспериментов, проведенных второй — испанской — группой исследователей. В этих экспериментах в почке конечности затормаживали активность факторов роста фибробластов с помощью блокировки одного из рецепторов, на которые они действуют. В результате прекращалась экспрессия маркеров дистальных участков конечности. Это означает, что для развития дистальной части конечности необходимо влияние FGF. Иными словами, факторы роста фибробластов имеют «дистализирующий» эффект, а ретиноевая кислота — «проксимализующий». В таком случае развитие того или иного участка конечности определяется балансом между концентрациями FGF и ретиноевой кислоты.

Итак, роль ретиноевой кислоты в образовании конечностей в «цыплячьих» экспериментах показана достаточно убедительно. Но, увы, триумф биологов развития омрачается одним обстоятельством. В недавних экспериментах было обнаружено, что у мышей ретиноевая кислота, наоборот, НЕ играет важной роли в развитии конечности по проксимально-дистальной оси. Может быть, так оно и есть, и млекопитающим для правильного развития конечностей не нужна ретиноевая кислота. А может быть, картина сложнее, и на самом деле ретиноевая кислота действует не сама по себе, а через цепочку неисследованных пока посредников. В любом случае, тема нуждается в дальнейших исследованиях.

Источники:
1) Kimberly L. Cooper, Jimmy Kuang-Hsien Hu, Derk ten Berge, Marian Fernandez-Teran, María A. Ros, Clifford J. Tabin. Initiation of Proximal-Distal Patterning in the Vertebrate Limb by Signals and Growth // Science. 2011. V. 332. P. 1083–1086.
2) Alberto Roselló-Díez, María A. Ros, Miguel Torres. Diffusible Signals, Not Autonomous Mechanisms, Determine the Main Proximodistal Limb Subdivision. // Science. 2011. V 332. P. 1086–1088.

Вера Башмакова


5
Показать комментарии (5)
Свернуть комментарии (5)

  • dims  | 14.06.2011 | 09:06 Ответить
    Мне кажется, количество управляющих веществ должно быть равно не двум, а совпадать по порядку величины с количеством структурных особенностей на конечности. То есть, для конечности их может быть и до 10.
    Ответить
    • VerBa > dims | 14.06.2011 | 11:22 Ответить
      Ну, это основные "дирижеры", и наверняка там есть еще целое море неисследованных веществ.
      Плюс к тому, не забывайте, это только проксимально-дистальная ось, на других осях другие управляющие вещества, и все это вместе работает.
      Ответить
    • A_CHE > dims | 14.06.2011 | 11:27 Ответить
      Не обязательно. Можно каждую особенность закодировать сочетанием веществ.
      Ответить
  • Александр Марков  | 16.06.2011 | 12:11 Ответить
    Вере мое почтение. Такую сложнятину и так внятно рассказать. Я вот посмотрел на одну из этих статей и подумал: не, убьюсь, поищу лучше чего попроще :)
    Ответить
    • VerBa > Александр Марков | 16.06.2011 | 22:04 Ответить
      Александр, большое спасибо! Я тоже Вашими статьями восхищаюсь:)
      Ответить
Написать комментарий


Элементы

© 2005-2017 «Элементы»